前 言
牙周炎发病极为广泛，也是在口腔中发病率最高的疾病之一，其临床表现为牙周支持组织的逐渐丧失，当疾病继续发展则可以导致牙齿松动和脱落，对口腔以及系统健康均带来巨大威胁。牙周炎是一种发生于牙周支持组织的慢性炎症，其造成支持组织丧失后仅靠牙周组织自身无法进行有效的修复和重建。探索牙周炎的病理变化可以让人们更好的了解该疾病，也可以为牙周炎的治疗提供新思路，因此对牙周炎病理机制的研究具有重要意义。间充质干细胞（MSCs）是一种成体干细胞，存在于人体内的多个组织，例如骨髓、脂肪组织、脐带等等。从不同部位获取的 MSCs 有着相似的生物学功能。随着对 MSCs 研究的逐渐深入，人们发现 MSCs 在维持组织微环境稳定方面有重要作用。MSCs 可以通过多种重要的旁分泌途径调节周边细胞并与周边细胞发生相互交流。有学者在牙周膜中也发现了同样特性的 MSCs，并命名为牙周膜干细胞（PDLSCs），验证了其具有多向分化的潜能[1]。然而在炎性环境的影响下，PDLSCs的功能却发生了变化[2]。在炎性环境中，MSCs 通过旁分泌与其周围微环境之间的交互作用会发生变化，从而对疾病产生影响。类似于 MSCs，PDLSCs 也具有旁分泌功能。PDLSCs 在炎性环境中或许也会发生相似的情况，从旁分泌角度去探索炎症中PDLSCs 与微环境的交互作用变化对于研究牙周炎病理机制具有重要意义。
在牙周炎症时牙周微环境主要表现为成骨失衡，其中的血管组织也发生了明显的变化。成骨失衡主要表现为牙槽骨的过度吸收，而在血管方面表现为血管密度增加和功能性状改变[3]，血管发生与慢性炎症之间联系密切且相互依赖。骨生成和血管形成也有着密切的联系，内皮细胞（ECs）作为在血管形成中具有重要作用的细胞，对 MSCs 的功能也具有调控作用。牙周膜组织血管丰富，ECs 广泛存在于其中，其也是构成牙周组织微环境的重要一员。在炎性环境下，PDLSCs 与 ECs 之间的交互作用可能发生了改变，进而 PDLSCs 的成骨能力和促血管生成能力也可能产生了变化。血管内皮生长因子（VEGF）曾经也被称为血管渗透因子，由促进血管形成的细胞分泌而来，是一种重要的信号分子。VEGF 可以促进血管内皮细胞的增殖，并促使血管通透性增加，在血管发生以及炎性疾病中起着关键的作用。牙周炎症时，在牙周支持组织内也发现了高表达的 VEGF。而 VEGF 同时也是 MSCs 旁分泌功能中的重要一员，那么其也可能参与到了炎性环境下 PDLSCs 与 ECs 的交互作用中。然而在炎性条件下 PDLSCs 的促血管形成能力如何变化，以及 VEGF 在其中所起到的作用目前还没有明确研究。本课题着力从细胞交互作用的角度来研究 PDLSCs 在炎性状态下成骨能力和促ECs 血管形成的变化，并试尝试阐述 VEGF 在其中所起的作用，同时也对此过程背后的分子机制进行初步探索，以期从新的角度来阐述牙周炎病理机制，并为干预治疗牙周炎微环境增加新的理论基础。
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文献回顾
牙周炎是口腔疾病中最常见的种类之一，发病率高，患病人群广泛。病情严重时可以导致牙齿的丧失，影响咀嚼系统的健康。牙周炎是慢性炎症性疾病的一种，因此也具有很多炎症性疾病的特征。在牙周炎的发展过程中，炎症性反应首先起始于牙龈，继而向下发展至龈沟内上皮组织、结合上皮组织和牙周膜及牙槽骨等，表现为牙周支持组织的局部充血、炎性细胞浸润、血管病理性增生、牙槽骨的吸收和胶原纤维的破坏等等。这些均提示在牙周炎的病理过程中，牙周组织的局部微环境发生了重要的改变，其间成骨和成血管的生物学效应都发生了变化。牙槽骨的丧失以及牙周膜组织的破坏可以导致牙齿的松动，进而影响牙齿的咀嚼功能，严重者将导致支持组织丧失，牙齿脱落。而在目前为止，对于修复和重建牙周炎所导致的牙周支持组织丧失仍然十分困难。基于以上种种原因，很多学者对于牙周病的病理机制和治疗方法展开了研究。在诸多牙周相关的研究中，有学者分离培养牙周膜组织中的一种成纤维细胞样细胞并对此细胞鉴定，发现其具有成体干细胞的特性，可以进行成骨、成脂、成纤维等多向分化，因此将其命名为牙周膜干细胞（PDLSCs）[1]，此研究发现使人们重新审视了牙周膜细胞的生物学功能。PDLSCs 为间充质干细胞（MSCs）的一种，有着各类 MCSs 兼有的共性。近年来 MSCs 得到了学术界越来越多的关注，MSCs 被认为对于维持局部微环境稳态有着重要的意义，其中的机制十分复杂。PDLSCs 对牙周局部环境有着同样重要的作用，对于特殊的炎性环境下 PDLSCs 自身生物学功能以及对于局部微环境影响的改变也是个非常值得探讨的课题，此方面的研究可以增加对牙周炎病理机制的理解，从而为牙周炎的治疗提供新的理论基础。以下本文将对与此相关的理论研究做一个综合性回顾。
一、炎症的牙周组织中存在血管的改变
当炎症发生时，炎症部位可表现为透红、局部温度升高，这与炎症区组织血管的改变有关。炎症时的血管会发生血管壁收缩舒张度、血流量及血管通透性等方面的改变。炎症性反应与血管的改变有着密切的关系。白细胞和炎性因子可促进血管增生，促血管因子可以直接作用于内皮细胞使其增殖、迁移，蛋白酶则可以通过分解细胞外基质从而促进血管出芽以及生长因子和促炎因子的释放，后者又可募集更多白细胞而加重炎症反应。大量的临床和实验都显示出促炎机制与促血管化机制间相互关系的复杂性，血管化可以将白细胞、血浆蛋白等输送至炎症部位，而在炎症反应中炎性细胞和间质细胞可分泌一系列调节因子来制造一个促血管发生的环境，从而增加血管形成。炎症组织细胞的增加及其代谢的增强都可以导致局部缺氧，缺氧也是血管发生和炎症反应的一个主要因素。在生理状况下，血管发生是由于缺氧组织有再灌注及氧补充的需求，而在病理状态下，紊乱的新生血管和炎症组织间质高压往往减少了有效的再灌注及氧补充。这些都说明血管发生和炎性反应的相互依赖在很多病症中起了重要作用。血管发生这一生物学现象广泛存在于哺乳动物的组织和器官中，在很多生理病理过程都包含了血管发生，例如胚胎发育、伤口愈合和慢性炎症。血管发生与一系列生长因子及促血管生成因子在不同时间及空间的调控有关，其也可以受到一系列抑制血管形成因子的调控。血管发生在很多病理过程中具有病因学及病理学上的重要意义，包括肿瘤，眼科疾病，慢性炎症如类风湿性关节炎、银屑病还有牙周炎。
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二、间充质干细胞及其生物学功能意义
干细胞（stem cells）分化程度低，它是一种可以分化成为多种成体细胞并能进行自我复制的细胞，普遍存在于多细胞生物中。哺乳动物中主要存在着两种干细胞：胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）。胚胎干细胞主要从胚胎内部的成胚区分离获得，而成体干细胞则可以从多种组织器官中获取。最近，学术界对成体干细胞的研究十分热门，因为成体干细胞在再生医学和肿瘤治疗中都具有很大潜力。成体干细胞具有高度的自我更新能力以及多方向分化的潜能，可以分化成为其来源组织中的所有成熟细胞[12]。间充质干细胞（MSCs）也是成体干细胞，在骨髓间质、皮肤真皮、胎盘和脂肪等组织中都包含有 MSCs。MSCs表现为一种成纤维细胞样的形态，具有间充质来源细胞的特征。在培养中 MSCs 极易贴壁，在成分简单的培养液中即可以快速增生，且多次传代后自身的染色体组依旧稳定不会发生变异。MSCs 同样具有分化成为多种类型细胞的潜能，例如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等一类中胚层来源细胞[13]。自发现以来 MSCs 逐渐受到重视，被广泛应用于免疫系统性疾病、肝肾等器官损伤、成骨及成软骨再生工程等的治疗研究领域中，并取得了可喜的成果[14-16]。
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第三部分 自噬对于 PDLSCS 促 ECS 血管形成能力的影响........ 68
1 材料 .... 69
1.1 主要试剂 .... 69
1.2 主要抗体 .... 69
1.3 溶液配方 .... 69
1.4 主要仪器 .... 70
2 方法 .... 71
2.1 细胞培养 .... 71
2.2 Western Blot ........ 72
2.3 qRT-PCR ........ 72
2.4 基质胶管腔形成试验 ........ 73
2.5 统计学分析 ........ 73
3 结果 .... 73
3.1 PDLSCs 的自噬水平随炎性因子刺激时间的延长先升高后有所降低 .... 73
3.2 ERK 可以正向调控 PDLSCs 的自噬水平 ........ 74
3.3 提高长期炎症环境下 PDLSCs 的自噬水平可增加其促 ECs 成血管能力 ........ 75
3.4 降低炎性 PDLSCs 自噬水平其促 ECs 血管形成能力也降低 .... 77
4 讨论 .... 78
第三部分 自噬对于 PDLSCs 促 ECs 血管形成能力的影响
自噬是一种细胞维持自身状态稳定的保守机制，其对于 MSCs 的自我更新、分化、增殖等生物学功能都有重要作用。随着对自噬研究的深入，人们发现很多的细胞信号通路都与自噬有关。ERK 具有多样的调节细胞生物学功能的作用，目前已有文献研究显示此重要的信号通路也可以调节自噬水平，自噬相关蛋白与 ERK 之间也有调控关系[114, 118]。从上一部分的研究结果可以得出，炎性 PDLSCs 的旁分泌作用在 ECs 的血管形成中起到了重要的作用，而 ERK 在其中起到了调控作用。那么自噬是否也有可能在炎性 PDLSCs 促 ECs 血管形成的过程中发挥了作用？目前学术界对于此方面尚没有研究。自噬在调节间充质干细胞生物学功能方面存在着非常复杂的机制，目前对这些机制的研究也未得出非常确定的结论，关于炎性环境通过调节 PDLSCs 自噬从而影响其周围微环境的报道更是缺乏。因此，探索炎性环境下 PDLSCs 是否以及如何通过自噬影响周边细胞血管生成可以弥补在这方面研究的不足，具有重要的指导意义。在此部分中，实验将对炎性环境下 PDLSCs 中 ERK 与自噬的关系，以及自噬是否参与调控炎性 PDLSCs 促 ECs 血管形成等方面进行探讨，希望能找到调控炎性PDLSCs 促进血管生成的新线索。首先，由于在上一部分实验中我们观察到炎性因子刺激的 PDLSCs 随炎性刺激时间的延长，其促 ECs 血管形成能力会发生变化的现象，因此我们在同样的条件下检测了炎性 PDLSCs 的自噬水平，以观察炎症环境下 PDLSCs 自噬水平变化与其促 ECs血管形成能力是否趋势一致。其次，我们进一步通过实验验证炎性环境下 PDLSCs中 ERK 通路与自噬的关系，用炎性因子与 U0126 去调控 PDLSCs 中 ERK 通路的激活水平，然后检测相应条件下 PDLSCs 的自噬相关蛋白 LC3、Beclin-1 等的表达来确定其自噬水平的变化。在确定炎性环境中 ERK 通路可以调控 PDLSCs 的自噬水平后，为了探索自噬在 PDLSCs 促 ECs 血管形成中的作用，我们使用 Rapamycin 来提高炎性 PDLSCs 的自噬水平，而后在共培养体系中检测 ECs 的管腔形成和成血管相关指标变化；Si-Beclin-1 则用来降低炎性 PDLSCs 的自噬水平，然后以相同的方法检测自噬水平下调的炎性PDLSCs对ECs血管形成能力的影响。本部分主要分为四个实验。
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小 结
牙周炎是发病率最高的口腔疾病之一，病情严重者可以导致牙槽骨大量减少和牙齿丧失。由于牙周炎属于一种慢性炎症性疾病，血管化在其发病机制中具有重要作用，因此研究牙周炎中的血管化机制具有重要意义。随着近年来人们对间充质干细胞研究的深入，牙周膜内的间充质干细胞——PDLSCs 被发现，且研究表明其在维持微环境稳定方面具有重要作用。在牙周炎的病理过程中，PDLSCs 的功能状态发生了改变，其可能受到周围微环境影响从而发生成骨能力的变化，同时改变了牙周炎症组织中的血管化进程。为了证明这一猜想，并尝试阐述其中的机理，本课题就此方面展开了研究工作。现将主要的研究成果总结如下：
1、 在研究正常与炎症状态 PDLSCs 在 ECs 影响下自身成骨水平变化的部分中，我们先用 ECs 的条件培养液 ECCM 来培养正常牙周组织来源、炎症牙周组织来源以及炎性环境下培养的 PDLSCs，结果发现三者的成骨分化水平并没有明显差异。而在将这几组 PDLSCs 与 ECs 间接共培养后，发现正常及炎性 PDLSCs 成骨分化水平均有下降，但同时凋亡水平下降。表明 PDLSCs 与 ECs 之间通过旁分泌途径的交互影响降低了不同状态 PDLSCs 的成骨分化水平，但改善了其生存状态。
2、 从以上结论可以得出 PDLSCs 与 ECs 之间可以通过旁分泌途径产生重要的交互作用，进而影响 PDLSCs 的生物学功能，这种交互作用也可能影响了 PDLSCs 的促血管化功能。又由于在本课题中观察到在炎性牙周膜组织内 VEGF 的表达量明显高于正常组织，因此我们对炎性 PDLSCs 促 ECs 血管化功能的变化、VEGF 是否参与其中以及其背后机理进行了探讨。研究表明在炎性环境下 PDLSCs 促 ECs 血管形成能力增强。在炎性因子的作用下，PDLSCs 中的 ERK 通路被激活，从而调控 PDLSCs分泌 VEGF 增加。炎性刺激下的 PDLSCs 正是通过 VEGF 的旁分泌途径来调控 ECs的血管形成。
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参考文献（略）