肾癌OSRC2细胞CD133的表达及意义

　　　　 作者：田福起 孙浩， 潘鹏， 郭涛

【摘要】 目的： 培养肾癌干细胞球，研究其表面分子特性。方法： 肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)和成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)的无血清培养基中培养，培养7天后收集细胞球，流式细胞仪检测CD133及CD34的表达。结果： 悬浮培养2天后出现肾癌干细胞球，培养7天后干细胞球明显增多，流式细胞仪检测发现表达CD133+CD34-细胞约占(8.33±1.26)%，对照肾癌细胞组表达CD133+CD34-细胞只占(1.24±0.36)%;干细胞球通过含10%胎牛血清培养基继续培养，又恢复原来的生长特点。结论： 利用无血清悬浮培养方法得到的肾癌干细胞球高表达干细胞表面分子标记CD133。

【关键词】 肿瘤干细胞; 肾癌; 细胞培养; CD133; CD34

　　[Abstract] Objective: To cultivate renal cell carcinoma(RCC) stem cells in serum free medium(SFM) with the method of suspension culture and to research their property of surface molecules on the cells.Methods： RCC cells were collected and dissociated in to single ones， then they were seeded in SFM containing EGF and bFGF. Seven days later the expression of CD133 and CD34 in cells from SFM was detected by flow cytometry. Results： RCC stem cells spheres were appeared after RCC cells had been cultured two days in SFM ; Seven days later， more spheres came out . Then collected and detected them by flow cytometry. We found that about(1.24±0.36)%CD133+CD34-cells were in normal OSRC2 cell line， while it reached to (8.33±1.26)% after cultivating in SFM for 7 days. After the cell spheres were recultivated in SSM， CD133+CD34-cells became less and close to before. Conclusion： RCC stem cells spheres enriched from RCC cells by SFM had higher expression of CD133.

　　[Key words] tumor stem cell; renal cell carcinoma(RCC); cell culture; CD133; CD34

　　肿瘤干细胞的鉴定主要利用细胞特异表面标志及侧群(side population， SP)检测。目前已相继从白血病、乳腺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤组织中得到了相应的肿瘤干细胞。本文旨在运用无血清培养基培养肾癌细胞，流式细胞仪鉴定其CD133，CD34的表达，明确肾癌干细胞的表面标志。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　CO2培养箱(上海力康)、流式细胞分析仪(BD公司)、超净工作台(苏州安泰)、Anke TDL5A离心机(上海安亭);肾癌细胞株OSRC2(上海中科院细胞库);DMEM高糖培养液(GBICO)、F12培养液(GBICO)、胎牛血清(杭州四季青)、bFGF(Prospec)、EGF(Prospec)、antiCD133PE(eBioscience)、antiCD34-FITC (Sigma)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 肾癌干细胞球的培养 取对数生长期的肾癌细胞OSRC2，用0.25%的胰酶消化，倒置显微镜下观察，待细胞由梭形变为圆形时加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化;收集细胞，1 500 r/min离心5 min;弃去上清，PBS漂洗1次，重新悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基(含EGF 20 μg/L， bFGF 20 μg/L);以终浓度2×105活细胞/ ml接种于75 cm2底面积培养瓶，在37℃，5%CO2培养箱进行悬浮培养，隔日换液;同时以高糖DMEM培养液培养细胞作为阴性对照。倒置显微镜下观察生长情况。

　　1.2.2 流式细胞仪检测CD133及CD34的表达 收集无血清培养7天的肾癌细胞球，1 500 r/min离心5 min，弃上清，用0.25%的胰酶将其消化成单细胞;1 500 r/min离心5 min收集细胞;弃去上清，PBS漂洗3次;加入PE标记的antiCD133，FITC标记的antiCD34各20 μl，室温避光孵育20 min后PBS漂洗1次，用抗鼠IgG1作同型对照进行流式细胞分析。同时收集阴性对照细胞进行流式分析。

　　1.2.3 肾癌干细胞球的分化培养 收集无血清培养7天的肾癌细胞球，重悬于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，接种于25 cm2底面积培养瓶，37℃，5% CO2培养箱进行培养，倒置显微镜下观察生长情况。

　　1.3 统计学处理

　　CD133及CD34的表达用均数±标准差(±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行配对t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 肾癌干细胞球培养生长过程观察

　　肾癌细胞接种于无血清培养基后可见细胞呈圆形悬浮于培养液;10 h后大部分细胞沉于瓶底，并有部分贴壁生长，仍有少量细胞悬浮;2 d后可见有细胞球的生成，每个细胞球大约有3～8个细胞，呈圆形，规则无突起，折光性较强;7 d后，细胞球明显增多，体积增大，致密，为规则的圆形或卵圆形(图1)。对照组细胞则贴壁生长，呈梭形或多角形，均匀散布于瓶底，没有细胞球的生成(图2)。

　　2.2 肾癌干细胞球CD133及CD34的表达情况

　　通过流式细胞分析可见悬浮培养的肾癌干细胞球中CD133高表达、CD34几乎不表达，存在(8.33±1.26)%的CD133+CD34-细胞(图3)，而正常培养的肾癌细胞只有(1.24±0.36)% (图4)，差别有统计学意义(t=-19.71，P&<0.05)。

　　2.3 肾癌干细胞球的分化过程观察

　　肾癌干细胞球悬浮于有血清培养液2天后可见致密的细胞球疏松分散，贴于瓶底，细胞呈梭形或多角形，生长特点基本同无血清悬浮培养前相同，CD133及CD34表达情况也基本与阴性对照相同，差别无统计学意义(t=0.39，P&>0.05)。

　　3 讨 论

　　肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)的发病率在全身恶性肿瘤中占3%左右，在泌尿系统肿瘤中占有重要地位[1，2]。但对于肾癌的病因、病理机理尚不清楚。近年来干细胞理论的发展，对肿瘤有了更深一层的认识。本实验试图通过无血清培养的方法得到肾癌干细胞，从而来研究肾癌的病因及机理。

　　该实验中我们应用无血清悬浮培养的方法培养肾癌细胞，2天后发现有细胞球的生成，7天后细胞球明显增多，并且体积增大，这些细胞球理论上是由肾癌干细胞单克隆增殖形成的肾癌干细胞球[3-6]。流式细胞分析得到的细胞球，发现有(8.33±1.26)%CD133+CD34-细胞，而阴性对照只有(1.24±0.36)%。CD34自发现以来一直作为干细胞表面标志物。它无种属特异性，选择性表达于造血干细胞，在血管内皮细胞也有表达。CD133是一种跨膜蛋白，属于Prominin家族成员，相对分子质量为120 ku，1997年Miraglia等[7]将其作为新的造血干细胞表面抗原提出。CD133主要表达于成人、胎儿骨髓，脐血，胎肝等造血组织的CD34+细胞亚群上，代表比CD34+更原始的造血干/祖细胞亚群。近年来发现CD133作为肿瘤干细胞特征性的表面标志物之一，已成为乳腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、肝癌、结肠癌、喉癌等实体瘤中肿瘤干细胞典型的分子标记，已经得到证实。Bussolati等[8]从正常成人肾脏皮质取材用免疫磁珠分选法首次分离到一种CD133+细胞，该细胞表达胚胎肾脏标志PAX2而不表达造血系统标志CD34和CD45，具有向上皮细胞和内皮细胞等分化的特点，提示这种肾源性CD133+细胞可能是肾脏干细胞。翟羽佳等[9]实验中亦证实肾透明细胞癌中存在少数CD133+具有干细胞特性的细胞。而我们通过无血清培养得到了富含CD133+CD34-细胞的干细胞球，它们高表达CD133，理论上是具有干细胞特性的肾癌细胞，即肾癌干细胞。这进一步证实了CD133在实体瘤干细胞的研究中起着十分重要的作用。它可以作为筛选干细胞的独立因素。CD34作为造血干细胞表面分子标记在这一细胞亚群几乎不表达，说明CD34尚不能作为分选鉴定肾癌干细胞表面分子标记。

　　我们把培养出来的细胞球重新在常规培养基中培养时，肾癌干细胞球悬浮于有血清的培养液2天后可见致密的细胞球疏松分散，有成团的细胞簇呈岛状贴于瓶底，细胞呈梭形或多角形，生长特点基本同无血清悬浮培养前相同。这说明促进细胞增殖保持分化的特殊条件去除时，将导致干细胞大量分化，数量减少;同时也提示普通的血清诱导分化环境可能不足以使RCC干细胞发生“终末分化”，在一定条件下，还可能回复其干细胞特性。

　　肿瘤干细胞理论发展到今天尚不完善，用来分离鉴定肾癌干细胞的表面标志尚需进一步探讨和证实，以便进一步研究肾癌干细胞的生长分化特性，从而来研究肾癌的病因及机理。本实验应用无血清悬浮培养的方法成功得到富含干细胞特性的肾癌干细胞球，通过研究发现CD34尚不能作为分离肾癌干细胞的表面分子标记，是肿瘤干细胞理论的重要补充。

参考文献

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