关于转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

　　【Abstract】AIM: To investigate the effect of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) on cell morphology and glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in rat cerebral cortical astrocytes in vitro. METHODS: Astrocytes cultured in vitro were pided into 4 groups: control group cultured with serumfree medium (SFM); TGFβ1 treatment groups cultured with SFM containing 1， 2， 4 μg/L TGFβ1. After cultivation for 24 h， the morphological change of astrocytes was observed by phasecontrast microscopy， and GFAP mRNA and protein expressions were examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and Western Blotting analysis， respectively. RESULTS: Along with the increase of the concentration of TGFβ1， the morphological change of astrocytes was progressively obvious and the expression of GFAP was also enhanced. CONCLUSION: TGFβ1 can upregulate GFAP expression and induce the change of astrocyte morphology.
　　【Keywords】 transforming growth factor beta 1; astrocytes; glial fibrillary acidic protein
　　【摘要】 目的： 研究转化生长因子β1 ( TGFβ1) 对培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响. 方法： 体外培养的大鼠皮层星形胶质细胞随机分为对照组(无血清培养基培养)和实验组(分别含1， 2， 4 μg/L TGFβ1的无血清培养基培养). 培养24 h后，用相差显微镜观察星形胶质细胞的形态学变化，用RTPCR和免疫印迹法检测GFAP mRNA和蛋白的表达. 结果： 随着TGFβ1浓度的增加，细胞变形趋势越来越明显，GFAP mRNA和蛋白表达也随之增加. 结论： TGFβ1 能上调星形胶质细胞 GFAP的表达并且诱导细胞发生形态改变.
　　【关键词】 转化生长因子β1; 星形细胞;神经胶质原纤维酸性蛋白质
　　0引言
　　
　　胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP ) 是脑内星形胶质细胞中间纤维的结构蛋白组成成分， 是一种能够反映星形胶质细胞功能状态的敏感指标. 转化生长因子β1(transforming growth factorβ1， TGFβ1) 在许多急慢性中枢神经系统功能紊乱的疾病(如脑卒中、Alzheimer病等)中发生改变，在各种类型的脑损伤中起重要作用. 因此，我们选取TGFβ1作为中枢损伤因素， 采用半定量RTPCR和免疫印迹法，试图在转录和翻译水平研究TGFβ1对培养的新生SD大鼠星形胶质细胞形态及GFAP表达的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料清洁级SD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供. Recombinant human TGFβ1购自美国R＆D Systems. OneStep RTPCR kit为日本Takara公司产品，购自宝生物（大连）有限责任公司. 兔抗GFAP和HRP标记兔抗羊IgG均购自博士德公司. 所有引物均由Primer Primer5.0软件设计，上海博亚生物技术有限公司合成. GFAP引物（694 bp）上游5TGC CGG CTT CAA AGA GAC TCG3；下游5CTG CAG TTG GCG GCG ATA GTC3. betaactin：引物（228 bp）上游5′AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC3′；下游5′CTC TCA GCT GTG GTG GTG AA3′. 其他的化学试剂均为市售分析纯试剂. 取新生1～3 d内的清洁级SD大鼠，无菌条件下取出大脑，置于DHanks液中，在解剖显微镜下剔除脑膜及血管组织，去除海马，将大脑皮质放入DHanks液中，用机械吹打法逐步移取上清液中的单细胞，1500 r/min离心5 min，弃上清液取沉淀，用含200 g/L高温灭活的胎牛血清（FBS）， 100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM制成悬液后，调节细胞密度为1×105 /cm2，种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中培养. 1 h后换培养瓶以去除成纤维细胞，随后3 d内不要移动培养瓶. 3 d后换液. 培养9～14 d，细胞融合后传代. 传3代后采用间接免疫荧光法监测星形胶质细胞特异性标志GFAP做细胞鉴定.
　　1.2方法取对数生长期的细胞，以1×105/cm2 传代于培养瓶中，继续培养至50%~60%融合后，换无血清培养基(serumfree medium， SFM) 同步24 h ，弃SFM，分别加入含0， 1， 2， 4 μg/L TGFβ1的SFM，分为4组培养细胞. 24 h后取出细胞，进行以下检测. 相差显微镜下观察细胞形态学变化.
　　1.2.1半定量RTPCR以Trizol 提取细胞总RNA ，用紫外分光光度计测定A260∶A280= 1.8～2.0. RT反应50℃ 30 min，Rtase失活94℃ 2 min. PCR反应条件为: 94℃ 30 s→52℃ 30 s →72℃ 1 min →GFAP 40个循环， βactin 40个循环. GFAP和betaactin 的扩增片段分别为694 bp 和228 bp . 取PCR 扩增产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，用ChemilnagerTM 550 型凝胶成像分析仪成像并进行图像分析，获得代表各电泳条带产量的吸光度A值. GFAP 和betaactin 电泳条带A值的比值为GFAP 相对吸光度(relative absorbance， RA)值，用以表示GFAP mRNA 的相对表达量.
　　1.2.2蛋白印迹分析星形胶质细胞被用单去污剂裂解缓冲液溶解，缓冲液包括100 mg/L PMSF， 1 mg/L aprotinin， 10 g/L Triton X100. 细胞溶解产物被以10 000 g 4℃离心10 min. 蛋白定量用Bradford法测定. 相同量的上清液被用于100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳. 被电泳分离的蛋白质被转到PVDF膜. 膜用含1 g/L Tween 20 和50 g/L BSA的TTBS［TTBS; 100 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）和 137 mmol/L NaCl］室温封闭2 h，抗GFAP抗体4℃孵育过夜（一抗1∶300稀释），再用辣根过氧化物酶结合的二抗（1∶6000）室温孵育膜1 h，最后用增强化学发光法直观观察.
　　2结果
　　不同浓度TGFβ1对星形胶质细胞光镜下的形态学变化：TGFβ1孵育后的细胞形态均发生改变，1 μg/L组细胞体积变大，胞突肥大，胞体肿胀；2 μg/L组由星形或多角形趋于扁平形，细胞体积明显变大，胞突消失. 随TGFβ1浓度的升高，4 μg/L组细胞形态变化的趋势更明显，细胞胞突消失，细胞膜不完整，细胞失去正常形态（图1）. TGFβ1 对星形胶质细胞表达GFAP mRNA 的影响(图2): 各组GFAP mRNA表达皆呈阳性，而且随着浓度的增加，表达量也增加. TGFβ1 对星形胶质细胞表达GFAP 蛋白的影响(图3): 各组GFAP表达皆呈阳性，而且随着浓度的增加，表达量也增加.
　　A: 0 μg/L; B: 1 μg/L; C: 2 μg/L; D: 4 μg/L.
　　
　　图1TGFβ1浓度对星形胶质细胞形态的影响（略）
　　图2TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAP mRNA的影响（略）
　　图3TGFβ1对星形胶质细胞表达GFAP蛋白的影响（略）

　　3讨论
　　
　　中枢神经系统的各种损伤及疾病发生后，反应性胶质化形成. 星形胶质细胞是组成胶质疤痕的主要胶质细胞成分，主要表现为胞体和突起的肥大， GFAP的大量合成与堆积，而星形胶质细胞的增生只是少数现象. 胶质化的星形胶质细胞， 形态改变，GFAP过度表达. 脑损伤后，可产生各种生长因子及细胞调节因子，包括TGFβ1. TGFβ1 刺激细胞外基质( ECM) 的产生，抑制蛋白酶和基质酶的活性，从而促进ECM沉积，促进组织损伤后的修复［1］. 即TGFβ1是一种重要的调节ECM合成的前纤维化调质［2］. 因为参与细胞的生长、分化及组织炎症、损伤修复等多种生物学作用， TGFβ1与中枢神经系统损伤的疾病关系密切，Nichols等［3］报道，在濒死的齿状回细胞，TGFβ1 mRNA增加. 故我们采用TGFβ1为刺激因子，建立大鼠皮层星形胶质细胞体外损伤的模型，研究脑损伤后反应性胶质化. 我们用不同浓度的TGFβ1刺激培养的星形胶质细胞，随着刺激因子浓度的增加，细胞的形态胞体和突起肥大的趋势越来越明显. 用4 μg/L TGFβ1孵育细胞24 h后，细胞形态变化的趋势更明显，细胞胞突消失，细胞膜不完整，细胞趋于崩解. 说明小剂量的TGFβ1促使星形胶质细胞活化，反应性胶质化形成. 随着剂量的增加，局部刺激浓度的增加，有可能会造成细胞崩解、死亡. 另外，也证明了TGFβ1对星形胶质细胞形态有影响. 在体外实验中，用TGFβ1处理星形胶质细胞，虽然细胞的形态学变化很小，但GFAP的mRNA和蛋白表达显著升高［4］. 在肝脏星形胶质细胞中，TGFβ1以时间和剂量依赖性的方式上调GFAP启动子的表达［5］.本研究表明，TGFβ1对星形胶质细胞形态、GFAP mRNA和蛋白表达的影响均随着浓度的增加而更为显著. Cancilla等［6］研究证实， 鼠脑损伤6 h就有GFAP mRNA 的表达， 5～7 d达到高峰， 7 d后回落， 持续14 d仍很明显. 表明星形胶质细胞激活后转录水平GFAP mRNA 的表达增加，此外GFAP 的降解在此情况下相对缓慢， 这对GFAP 的增多起了协同作用. 对于TGFβ1 4 μg/L处理组细胞，细胞形态趋于崩解，而GFAP的转录和合成的量均为最高，可能的原因与此有关. 反应性星形细胞在脑损伤发生发展恢复的一系列过程中均起着重要作用，胶质纤维酸性蛋白GFAP的表达可作为研究中枢神经系统(CNS)损伤后星形细胞由常态转化为反应态的胶质反应的一项生化指标［7］. 研究转化生长因子β1细胞形态及GFAP表达的影响，可能为治疗CNS损伤后治疗提供新的治疗思路.

参考文献

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　　［2］ Kirwan RP， Leonard MO， Murphy M， et al. Transforming growth factorbetaregulated gene transcription and protein expression in human GFAPnegative lamina cribrosa cells［J］. Glia， 2005， 52(4):309-324.

　　［3］ Nichols NR， Agolley D， Zieba M， et al. Glucocorticoid regulation of glial responses during hippocampal neurodegeneration and regeneration［J］. Brain Res Brain Res Rev， 2005， 48(2):287-301.

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　　［5］ Maubach G， Lim MC， Zhang CY， et al. GFAP promoter directs lacZ expression specifically in a rat hepatic stellate cell line ［J］. World J Gastroenterol， 2006，12(5):723-730.

　　［6］ Cancilla PA， Bready J， Berliner J， et al. Expression of mRNA for glial fibrillary acidic protein after experimental cerebral injury［J］. J Neuropath Exp Neurol， 1992，51(5): 560-565.

　　［7］ 李玉红，闫平. 脑损伤后GFAP和NGF的表达研究进展［J］.中国法医学杂志， 2003，18（6）:378-380.