紫杉醇对HEC1B细胞凋亡诱导作用的实验分析

【摘要】 目的： 探讨紫杉醇对体外培养的人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B）细胞凋亡的诱导作用. 方法： 体外培养HEC1B细胞，用浓度2， 4， 8， 16， 20 nmol/L的紫杉醇作用细胞12 h，24 h，48 h后，提取细胞DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳；消化HEC1B细胞并经碘化丙锭(PI)染色后，流式细胞仪(FCM)对细胞进行细胞周期分析；电子显微镜对紫杉醇作用后的HEC1B细胞进行形态学分析. 结果： 体外培养的HEC1B细胞经不同浓度的紫杉醇处理后，细胞生长明显受到抑制；于8 nmol/L紫杉醇作用48 h后可观察到细胞凋亡特异的DNA梯状电泳；流式细胞仪分析证实，细胞凋亡率达19.7%；且电镜下可观察到典型的凋亡早期形态学改变. 结论： 人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B）细胞对紫杉醇具有药物敏感性，紫杉醇对HEC1B细胞的杀伤作用，是通过诱导细胞凋亡途径实现的.
【关键词】 紫杉酚；子宫内膜肿瘤；腺癌； HEC1B； 细胞凋亡
　　【Abstract】 AIM: To investigate the inhibition of proliferation and the induction of apoptosis in in vitro cultured human endometrial adenocarcinoma cell HEC1B by taxol. METHODS: Human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells were cultured in vitro and treated with 2， 4， 8， 16， 20 nmol/L taxol for 12， 24， 48 h respectively. Isolated DNA fragments from HEC1B cells were analyzed by agrose ge1 electrophoresis. Apoptotic index in HEC1B cells stained with PI was detected with flow cytometer (FCM)assay. Electron microscopy was used to observe the morphological changes of HEC1B cells after treated with taxol. RESULTS: After treated with 8 nmol/L taxol for 48 h， DNA ladder tormation was observed in HEC1B cells. Typical apoptotic appearance was seen under an electron microscope. FCM assay revealed that the apoptotic rate was 19.7%. CONCLUSION: Taxol inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human endometrial adenocarcinoma cell HEC1B.
　　【Keywords】 paclitaxel; endometrial neoplasms; adenocarcinoma; HEC1B; apoptosis
　　　0引言
　　子宫内膜癌(endometrial cancer， EC)是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%~30% . 在治疗方面一直沿用传统的手术或手术加放疗. 因此，疗效及治愈率无提高. 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用，在晚期肿瘤的治疗中尤为重要. 近年来，子宫内膜癌的发病率有所上升，为了进一步提高子宫内膜癌的疗效，探索新的合适的化疗药物很有必要.
　　紫杉醇(Taxol， Paclitaxe1)是20世纪70年代首先从美国西部紫杉中分离得到的，它在癌细胞分裂时能与细胞微管蛋白结合，促使细胞中微管稳定和聚合，使细胞有丝分裂受到阻断，从而抑制肿瘤生长［1］. 早期在卵巢癌细胞的体外实验中发现，紫杉醇的细胞毒性与其诱发细胞凋亡有关［2］. 紫杉醇作为新一代化疗药物，其开发和应用已大大提高了卵巢癌的临床疗效. 为进一步明确其对子宫内膜癌的治疗作用，本实验在体外研究紫杉醇对HEC1B细胞增殖的抑制作用和诱导凋亡作用奠定基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料HEC1B子宫内膜腺癌细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞所，紫杉醇购自北京四环医药科技股份有限公司. 噻唑蓝(MTF)，EMEM 培养基为美国Gibco公司产品.
　　1.2细胞培养人子宫内膜腺癌细胞株HEC1B培养于EMEM培养液中(含100 mL/L胎牛血清， 1.0 mmol/L丙酮酸钠，1.0 mmol/L非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠，pH 7.0～7.2)，于37℃， 50 mL/L CO2培养箱中培养，每48 h换液一次. 细胞呈单层贴壁生长，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 选用对数生长期细胞进行实验［4-5］.

　　1.3细胞增殖活力检测将贴壁细胞消化传代后计数，调整细胞浓度为1×104/mL，接种于24孔培养板中，37℃， 50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养. 实验时分为2， 4， 8， 16， 20 nmol/L 5个药物浓度组及对照组，每组5个孔，细胞接种后24 h加药，分别于加药后12， 24， 48， 72 h测定各孔的吸光度值（A值）. 测定前弃去培养孔上清后，每孔加500 μL新配制的5 g/L MTT，37℃继续孵育4 h，弃上清加150 μL DMSO溶解，混匀后用DG3022型酶标仪，在490 nm波长处测定细胞的光吸收值，并按肿瘤细胞抑制率=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%.
　　1.4紫杉醇对细胞超微结构的影响收集浓度为8 nmol/L的紫杉醇作用48 h的细胞及对照组细胞，PBS洗涤2次，离心后弃上清，先加入30 g/L戊二醛固定，后10 g/L的锇酸固定50 min，脱水、包埋、聚合，按常规方法制备电镜超薄切片，醋酸双氧铀和硝酸铅染色，透射电镜观察细胞超微结构.
　　1.5琼脂糖凝胶电泳收集上述细胞，调整浓度为1×107/mL，离心，弃上清，溶解于500 L细胞核裂解液中作用4 h， 4℃ 12 000 g离心15 min，收集上清0.5 mL平衡酚抽提，混匀，离心15 min收集上清，加0.5 mL氯仿，异物醇抽提，混匀，离心15 min，收集上清，加50 L乙酸钠和无水乙醇2 mL混匀，-20℃ 过夜，离心沉淀10 min，弃上清，加80 L的 TE和2 0 μL的RNase 5 μL置37℃孵育2 h，取20 L加上样缓冲液5 L上样，15 g/L琼脂糖凝胶电泳，35 V电压1.5 h，紫外灯下观察.
　　1.6流式细胞仪分析8 nmol/L的紫杉醇处理后的细胞培养48 h后，经常规预处理后，流式细胞仪(FCM)测定亚二倍体峰及各个细胞周期细胞凋亡情况. Multcycie软件处理结果后. 以未加药者为对照组.
　　2结果
　　2.1紫杉醇对人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B）的生长抑制作用2~16 nmol/L的紫杉醇分别作用l2， 24， 48， 72 h后，对肿瘤细胞生长抑制作用结果表明： ① 随着剂量增加，细胞存活率降低，有明显的剂量依赖关系； ② 24 h后，6 nmol/L以上浓度的紫杉醇具有明显抑制细胞生长的作用. ③ 48 h后最低抑制浓度为2 nmol/L，随着时间的延长，药物的敏感性增加，同一剂量的药物有时间依赖关系(图 1).
　　图1紫杉醇诱导HEC1B 细胞凋亡抑制率（略）
　　2.2电镜观察结果对照组正常肿瘤细胞生长旺盛，核大且不规则，胞膜完整，胞质内细胞器丰富，清晰，线粒体、内质网丰富，部分可见细胞分泌，长的可见线粒体表示细胞连接好（图2A）；在药物作用浓度48 h后，出现了细胞早期凋亡，肿瘤细胞染色质固缩，聚集在核膜周边成新月形，线粒体肿胀、脊断裂，出现凋亡小体（图2B）. 晚期凋亡细胞器崩解，细胞线粒体，内质网都有所改变，核固缩（图2C）.
　　2.3琼脂糖凝胶电泳结果当紫杉醇的浓度为8 nmol/L时，作用24， 48 h后，电泳结果清楚显示DNA梯形带(图 3).
　　2.4流式细胞仪分析HEC1B经紫杉醇作用、PI染色后，流式细胞仪进行分析显示：细胞因增生受抑制会出现明显的G13.1百分比增高，G2/M+S百分比降低. 8 nmol/L的紫杉醇作用48 h的细胞有明显凋亡峰(图4A). 未经紫杉醇处理的对照组细胞G15.7，峰前无凋亡峰或坏死细胞的峰，无亚二倍体峰出现(图4B).
　　A： 对照组； B，C： Taxel组.
　　图2紫杉醇处理后HEC1B细胞的超微结构变化（略）
　　图3紫杉醇处理后HEC1B细胞cDNA琼脂糖凝胶电泳（略）
　　A: Taxel 48 h; B: 对照组.
　　图4紫杉醇处理后HEC1B细胞周期性变化（略）
　　
　　3讨论
　　
　　细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，是细胞主动参与的“自杀”机制. 近年来的研究表明，许多抗肿瘤药物均可诱导肿瘤细胞凋亡．这也可能是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机理之一［6］. 化疗药物主要通过诱导癌细胞的凋亡达到治疗目的，癌细胞对化疗药物的敏感性决定了抗癌的有效性. 紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物，作用的目标是细胞骨架的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响到微管聚合与解聚的动态平衡，诱导多种肿瘤细胞发生凋亡［7］. 我们对紫杉醇处理的人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B）进行了检测，发现紫杉醇对其具有显著的生长抑制作用，并且存在着有明显的剂量依赖关系. 通过超微结构的分析，多核细胞的各核内均可见染色体凝集，并呈新月状附着于核膜，进一步证实多核细胞为早期凋亡细胞. 另外，电镜观察可见经紫杉醇诱导后有凋亡小体、髓样小体、多泡体等结构出现. 髓样小体、多泡体病理上多见于受损及衰老细胞，因此形态学的表现提示紫杉醇具有明显的细胞毒性和促凋亡作用. 同时，流式细胞仪分析观察到细胞凋亡相关的亚二倍体峰型，其作用机制主要表现为DNA合成期及G2M 期阻滞和一定数量的细胞凋亡. 这与相关［8］研究的紫杉醇对人胆管癌细胞的作用相似.

　　内源性核酸内切酶激活、DNA断裂是细胞凋亡的重要过程. 本实验中，琼脂糖凝胶电泳显示：加药组细胞DNA呈明显的梯状带，证明紫杉醇作用后细胞内内源性核酸酶活性增高，将核小体之间DNA 切割形成180~200 bp 的多聚体. 说明经紫杉醇诱导产生的细胞核内有广泛的DNA断裂，属凋亡的早期改变. 以上结果都证明紫杉醇能够对人子宫内膜腺癌细胞（HEC1B）产生细胞凋亡诱导作用.
　　
　　恶性肿瘤治疗的另一大障碍，是对化疗药物的耐药性问题［9］. 使肿瘤细胞逃逸化疗药物的杀伤，紫杉醇对正常细胞的副作用小，对肿瘤细胞的直接杀伤作用强；与化疗药物之间无交叉耐药，且有明显的协同作用. 研究证实，紫杉醇通过调节细胞凋亡相关基因的表达、启动肿瘤细胞凋亡信号通路，抑制肿瘤细胞的增生，抑制其侵袭性转移，最终杀伤肿瘤细胞［10］. 因此，进一步明确紫杉醇在诱导人子宫内膜腺癌细胞细胞凋亡的分子生物学机制是值得研究的问题.
　　
　　总之，紫杉醇对人子宫内膜腺癌细胞有较强的诱导凋亡能力. 进一步研究紫杉醇对子宫内膜癌细胞诱导凋亡的分子生物学机制对于临床应用将有很大的帮助.
【参考文献】
　　［1］ Lane DP. A Death in life of p53. Nature［J］. 1993，362:786-788.

　　［2］ Pisano C， Greggi S， Tambaro R， et al. Activity of chemotherapy in mucinous epithelial ovarian cancer:a retrospective study［J］. Anticancer Res， 2005，25(5):3501-3505.

　　［3］ 李桂云，陈必良，马向东，等. 紫杉醇对浆液性卵巢癌细胞HO8910 细胞凋亡的诱导作用［J］. 肿瘤研究与临床，2004，l6(l):11-13.

　　［4］ 司徒镇强，吴军正. 细胞培养［M］. 西安：图书出版公司，1996:134-135.

　　［5］ 李玉松，张远强. 组织病理学技术［M］. 北京：人民卫生出版社，2000:870.

　　［6］ Choy G， Liu JW， Chandra D， et al. Cell survival signaling during apoptosis: implications in drug resistance and anticancer therapeutic development［J］. Prog Drug Res， 2005，63:115-145.

　　［7］ Havrilesky LJ， Elbendary A， Hurteau JA， et al .Chemotherapyinduced apoptosis in epithelial ovarian cancers［J］.Obstet Gynecol， 1995，85(6):1007-1010.

　　［8］ 张爱武，张苏江，姜藻．紫杉醇对卵巢癌细胞基质金属蛋白酶2，9基因表达的影响［J］.现代妇产科进展，2002，11(2)：331-333．

　　［9］ Basse B， Baguley BC， Marshall ES， et al. Modelling cell death in human tumour cell lines exposed to the anticancer drug paclitaxel［J］. J Math Biol， 2004，49(4):329-357.

　　［10］ Marcus AI， Peters U， Thomas SL， et al. Mitotic kinesin inhibitors induce mitotic arrest and cell death in Taxolresistant and sensitive cancer cells［J］.J Biol Chem.2005，25，280(12):11569-11577.