关于罗格列酮对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制

　　　　　　　　作者：朱肖星　牛小麟　魏瑾　陈定章　朱萧玲　马晓涛　高登峰　郝广华　李高中　徐琳　王文清

【摘要】 目的： 以新生大鼠心肌细胞为模型，探讨罗格列酮(RSG)对内皮素1(ET1)引起心肌细胞损伤的保护作用及其机制. 方法： 将原代培养的心肌细胞分为5组: DMEM组， ET1组， ET1+ RSG(10-9mol/L)组、ET1+ RSG (10-8mol/L)组、ET1+ RSG (10-7mol/L)组; 培养24 h和48h ，吸取培养液；按试剂盒说明书进行测定心肌细胞培养液中LDH， SOD 活性及MDA 含量. 结果： 药物干预24和48 h后，培养液中LDH的活性，ET1组均高于对照组（分别为P＜0.05， P＜0.01），ET1+ RSG组均低于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG + ET1组较ET1组降低有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）；SOD 活性：ET1组均低于对照组（分别为P＜0.05， P＜0.01），ET1+ RSG组均高于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG + ET1组较ET1升高有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）；MDA 含量：ET1组均高于对照组（分别为P＜0.05， P＜0.01），ET1+ RSG组均低于ET1组，其中10-8mol/L和10-7mol/L RSG + ET1组较ET1降低有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）. 结论： RSG对内皮素引起心肌细胞损伤的保护作用及机制与抗氧化 、降低氧自由基的产生有关.
【关键词】 罗格列酮 ，内皮缩血管肽1，心肌/细胞学
　　【Abstract】 AIM: To investigate the protective effect of rosiglitazone (RSG) on endothelin1 (ET1)induced cardiomyocyte injury and its mechanism. METHODS: The cultured primary cardiomyocytes from neonatal rats were randomly pided into DMEM group(control group)， ET1 group， ET1 + RSG(10-9mol/L)group， ET1 + RSG (10-8mol/L)group and ET1+ RSG (10-7mol/L) group， respectively.The supernates were taken and detected before and 24 and 48 h after intervention for the levels of LDH， MDA and SOD with biochemical techniques. RESULTS: At 24 and 48 h， the level of LDH in ET1 group was higher than that in control group（P＜0.05， P＜0.01， respectively）， and also higher than those in ET1+ RSG groups， especially 10-8mol/L and 10-7mol/L RSG + ET1 groups （P＜0.05， P＜0.01， respectively）. The activity of SOD in ET1 group was lower than that in control group（P＜0.05， P＜0.01， respectively）， and those in ET1+ RSG groups， and particularly 10-8mol/L and 10-7mol/L RSG + ET1 groups were significantly higher than ET1 group in SOD activity（P＜0.05， P＜0.01， respectively）. The concentration of MDA in ET1 group was higher than that in control group（P＜0.05， P＜0.01， respectively）and those in ET1+ RSG groups; 10-8mol/L and 10-7mol/L RSG + ET1 groups were significantly lower than ET1 group in MDA concentration（P＜0.05， P＜0.01， respectively）. CONCLUSION: RSG protects cardiomyocytes from the ET1induced injury， which may be related to its antioxidant potential and depression of oxygen free radicals production.
　　【Keywords】 rosiglitazone (RSG)， endothelin1 (ET1)， myocardium/cytology
　　0引言
　　大鼠心肌细胞有内皮素特异性受体. 在培养新生大鼠心肌细胞中，内皮素1(endothelin1， ET1)，可诱导心肌肥大、增加蛋白质的合成， 是引起心肌肥大的因子［1］. 随着ET1研究的深入， 现已证实，ET1有引起心肌细胞损伤和心律失常的效应. 高血压患者，ET1浓度的升高. PPARγ的激动剂罗格列酮(rosiglitazone， RSG)在动物实验中已发现可以通过降低高血压大鼠的血压、ET1的浓度和抗心肌肥大的作用［2］，但整体动物实验影响的因素较多，本实验采用培养大鼠的心肌细胞. 我们研究PPARγ的激动剂RSG对ET1引起心肌细胞损伤的保护作用及其机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　1~3 d龄新生SD品系大鼠乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产；考马斯亮蓝G250由华美生物工程公司提供；高糖DMEM培养基、5′溴脱氧尿苷（Brdu）和ITS是GIBCO产品， ET1， 胶原酶1均为Sigma公司的产品，RSG是Alexis公司的产品，LDH试剂盒、丙二醛试剂盒和SOD检测试剂盒均由南京生物工程研究所生产.
　　1.2方法
　　1.2.1新生大鼠心肌细胞的分离与培养参考文献［3］在无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，用胶原酶110 g/L消化成单细胞悬液，离心（1000 r/min， 5 min）弃上清，加入含100 mL/L新生牛血清，0.1 mmol/L Brdu的高糖DMEM重新悬浮，孵育90 min，收集未贴壁细胞(95%以上为心肌细胞)用于实验.
　　1.2.2分组将心肌细胞接种于24孔培养板［5×105细胞/(ml·孔）］，培养48 h， 换含10 g/L ITS的无血清高糖DMEM培养液，24 h 后每8孔为1组，随机分为对照组， ET1组， ET1+RSG (10-9 mol/L)组、ET1+RSG (10-8 mol/L)组， ET1+RSG (10-7 mol/L)组，培养24 h和48h ，吸取培养液，于-20℃冻存待测.
　　1.2.3心肌细胞培养液中LDH， SOD 活性及MDA含量的测定按试剂盒说明书进行操作［4］.
　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析（ANOVA），均数间的多重比较用 SNKq检验，，用Origin统计软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1RSG抑制ET1引起 LDH 活性的升高ET1组， ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组LDH 活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h， 48 h LDH 活性较正常对照组增强，，差异有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）. RSG减弱ET1 引起 LDH 活性的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可抑制ET1引起LDH 活性的升高（P＜0.05，表1). 表1RSG抑制ET1引起 LDH 活性的升高(略)
　　2.2RSG恢复ET1引起 SOD 活性的降低ET1组， ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组SOD 活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h， 48 h SOD活性较正常对照组减弱，差异有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）. RSG可恢复ET1引起SOD 活性的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可恢复ET1所致的SOD活性的升高（P＜0.05，表2). 表2RSG恢复ET1引起 SOD 活性的降低(略)
　　2.3RSG抑制ET1引起 MDA 含量的升高ET1组， ET1+RSG不同浓度组给药前与正常对照组MDA含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），ET1组24 h， 48 h MDA含量较正常对照组增加，差异有统计学意义（分别为P＜0.05， P＜0.01）. RSG减弱ET1引起 MDA含量的升高，10-8 mol/L和10-7 mol/L RSG均可抑制ET1引起MDA含量的升高（P＜0.05，表3). 表3RSG抑制ET1引起 MDA 含量的升高(略)
　　3讨论
　　ET1是含有21个氨基酸残基的血管活性多肽，它有调节细胞增生、促进血管和心肌重构的作用［5-6］，外源性ET1可以引起心肌缺血性损伤和心律失常. 在整体动物实验中，ET1的效应不能区分直接还是继发于ET1缩血管产生的效应. 本研究选用培养心肌细胞模型，在细胞水平观察ET1对心肌细胞的直接影响，排除了整体或离体心脏实验中ET1收缩血管的因素. 内皮素作用心肌细胞后，细胞培养液中LDH活性的增加提示心肌细胞损伤，细胞内酶漏出，，培养液中SOD活性的降低和MDA含量的增加，SOD具有清除氧自由基和抗氧化损伤的能力，MDA是细胞脂质过氧化作用的产物. 内皮素作用下，SOD活性降低和MDA含量增加，表明心肌细胞的抗氧化损伤的能力明显下降. RSG抑制内皮细胞产生ET1，体内、体外实验证明RSG有抑制心肌肥大的作用. 我们证明RSG可以降低内皮素引起LDH的升高，说明RSG对心肌细胞有保护作用. RSG在高胆固醇血症中保护血管效应与抗氧化有关［7］. RSG可恢复内皮素引起SOD活性的降低，保护心肌细胞的损伤也与抗氧化有关. RSG可以降低MDA含量的增加，说明RSG可以抑制内皮素诱导细胞脂质过氧化作用的增强.

转贴于 　　内皮素导致细胞的损伤是一个复杂的过程. ET1与受体结合后，激活磷脂酶C又水解磷脂酰肌醇生成1，4，5三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油（DAG）. IP3引起肌浆网储存钙的释放，钙离子又通过L型钙通道从细胞外进入细胞内，使得细胞内游离钙增加. 胞内钙和DAG可激活PKC，并促进心肌细胞Na+/H+交换，增加胞浆钠浓度，降低H+浓度使胞浆碱化，胞浆Na+浓度升高又可激活Na+/Ca2+交换，促进Ca2+内流引起钙超载［8-10］. 王庭槐等［11］发现用PKC激动剂PMA预处理耗竭或减少心肌细胞的PKC，能明显减弱ET1诱导瞬时［Ca2+］i的升高，说明PKC在ET1诱导瞬时相的［Ca2+］i升高中起重要作用. RSG可减弱ET1和PKC激动剂PMA引起的心肌肥大［12］，说明RSG可能部分阻断PKC途径抑制ET1引起的心肌肥大，减少了随后Na+/H+交换和Na+/Ca2+交换的激活，抑制钙的内流，减轻细胞的钙超载. 此外RSG是胰岛素的增敏剂，胰岛素对心肌细胞的损伤有保护作用，因此，RSG的效应也可能部分是胰岛素的保护作用［13］.

参考文献

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