本文是一篇药学论文，本研究采用MTT法和细胞划痕（修复）法进行体外细胞实验测定双硫仑联合藤黄对肿瘤细胞的抑制作用。根据结果推测双硫仑与藤黄联用能够抑制肿瘤细胞的生长和迁移，体外抗肿瘤活性优于双硫仑和藤黄单一用药，且随着用药时间的延长，药物的药效逐渐增强。
1 绪论
1.1 引言
世界上威胁人类生命健康的疾病有很多，恶性肿瘤是目前的最为致命的疾病之一。根据2020年世界癌症调查情况的报告显示，全球的癌症新发病例从2008年的1270万增加到2020年的1930万，逐年递增的趋势未来很有可能延续下去[1]。最新报道显示，肿瘤的发病率和死亡率近些年来越来越趋于年轻化，这可能与年轻人的饮食卫生和不良生活习惯有关[1, 2]。肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道肿瘤之一，根据2020年世界范围内新发病例统计，肠癌新发病例位居第三（约193万），死亡病例位居第二（约94万），对人类的生命健康构成严重威胁[3]。由于肠癌易发生肿瘤转移，这大大增加了其治疗的难度，其中肝脏是肠癌极易转移的器官，据统计，15%-25%的肠癌患者在经过临床确诊时，肿瘤就已经不同程度的转移至了肝脏部位，25%-50%的肠癌患者在术后三年内也会发生不同程度的肝脏转移[4]。
对于肠癌的肝转移瘤，目前最常见的治疗方式是进行手术切除，通过切除手术，可以延长患者的生存时间，甚至是治愈[5]。但是手术的方法，只能切除一些肉眼可见的较大的转移灶，对于那些肉眼看不见的肿瘤却束手无策。对于那些年龄较大、体质较弱的患者，不适合采用手术的方法进行治疗，或者是手术后再次复发的患者，多采用化疗为主[6]，化疗对于杀死肿瘤细胞具有一定的效果，但是目前临床上抑制肠癌肝转移所用药物单独使用时效果不明显，用药时间久了会使肿瘤细胞产生耐药性[7]。因此如果能将两种抑制肠癌肝转移的药物联合互补使用可能会在一定程度上有效遏制病情的发展，延长患者的生存期。
双硫仑（Disulfiram，DSF）别名戒酒仑，分子式为 C10H20N2S4，在临床上是一种戒酒药物，DSF也具有抗肿瘤活性，因其成本低、易获得、毒副作用小，近年来备受关注。有研究表明，双硫仑对于肿瘤细胞的杀伤效果依赖于Cu2+或其他二价金属离子，两者在一起形成的螯合物能够起到杀伤肿瘤细胞的效果[8]。
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1.2 双硫仑概述
1.2.1 双硫仑简介
双硫仑（Disulfiram，DSF）别名戒酒仑，也称为二硫化四乙基秋兰姆，在临床上是一种戒酒药物，DSF也具有抗肿瘤活性，因其成本低、易获得、毒副作用小等优点受到研究者的青睐。有研究表明，双硫仑对于肿瘤细胞的杀伤效果依赖于Cu2+或其他二价金属离子，两者在一起形成的螯合物能够起到杀伤肿瘤细胞的效果[11]。
1.2.2 双硫仑的基本信息
中文名称：双硫仑 中文别名：二硫化四乙基秋兰姆 英文名称：Disulfiram 分子式为 C10H20N2S4 分子量：296.53900 结构式：
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2 双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体外活性研究
2.3 细胞培养
2.3.1 细胞复苏
1. 实验开始前先用紫外灯将细胞间灭菌30 min，将实验所用器材用灭菌锅高压灭菌处理，以保证细胞培养过程的无菌环境。首先配制培养小鼠结肠癌CT26.WT细胞所需的培养液（RPMI-1640基础培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素），配置完成后用水浴锅（37℃）预热10 min，75%酒精喷洒消毒后放入洁净工作台内备用。
2. 打开液氮罐，用镊子从中取出含有小鼠肠癌CT26.WT细胞的冻存管，迅速放入37℃的水浴锅中解冻，期间用镊子夹住细胞冻存管不断地晃动，使冻存管内液体尽量在短时间内解冻完全。
3. 冻存细胞解冻完全后，将冻存管表面用75%酒精消毒，放入洁净操作台中，用移液枪缓慢吹打冻存管内细胞，吹打均匀后转移至含有5 mL细胞培养液的离心管中，封上封口膜，配平后离心（转速：1500 r/min，离心时间：10 min）。离心结束后小心取出离心管，可观察到其底部含有细胞沉淀物。
4. 离心后小心移去上清液，向沉淀下来的细胞中加入5 mL配置好的CT26.WT细胞培养液，用移液枪缓慢吹打细胞数次，全部转移至新的细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞呈单细胞悬液后，将细胞培养瓶放置于37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养。
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2.4 双硫仑联合藤黄对细胞迁移的影响
本实验采用划痕（修复法）测定双硫仑联合藤黄对细胞迁移的影响。首先取处于对数生长期的小鼠肠癌CT26.WT细胞无血清处理24 h，用含有10%FBS的RPMI-1640培养液稀释到细胞浓度为1×106个/mL，接种于六孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞长满80%以上后，取出六孔板。划痕时用10 μL枪头沿着六孔板直径划下，每次划痕尽量保证一次划下。用PBS将每孔冲洗3次，洗去划掉的细胞，设置空白组、双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组以及5-氟尿嘧啶组（体外细胞实验阳性对照药物使用卡培他滨的前药5-氟尿嘧啶），给药浓度为药物IC50值的1/2，之后将六孔板放进37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h，分别在0 h和24 h在正置荧光显微镜观察迁移程度，实验重复3次，比较各组药物对细胞的迁移的影响，用Image J软件计算各组细胞的迁移率，分析双硫仑联合藤黄对细胞迁移的影响[51, 52]。
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3 双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体内活性研究 ........................16
3.1 实验材料与试剂 .....................................16
3.2 实验仪器 ..............................................16
3.3 小鼠肠癌肝转移模型的建立 ...............................16
4 双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的机制研究 ..............................25
4.1 实验材料与试剂 ..........................25
4.2 实验仪器 ................................25
4.3 联用药物体内转化过程的研究 ........................25
5 计算机虚拟筛选联用药物作用靶点 .....................................36
5.1 数据来源 .................................36
5.2 实验内容 ................................36
5 计算机虚拟筛选联用药物作用靶点
5.1 数据来源
PubChem是由美国国家健康研究院(US National Institutes of Health,NIH)支持，基于美国国家生物技术信息中心生物信息平台建立的一个开放数据库，旨在促进小分子数据资源的公共利用。PubChem数据库包括3个子数据库：PubChem Substance用于存储机构和个人上传的化合物原始数据，现有数据8.7×106条；PubChem Compound库用于存储整理后的化合物化学结构信息，现有化学结构3×107个；PubChem BioAssay库用于存储生化实验数据，现有生化实验超过5.8×105项，实验数据主要源自高通量筛选实验和科技文献。3个数据库彼此联系，可以互相访问，并与NIH下属的其他蛋白、核酸、基因、文献等数据库相链接，帮助用户快速获取相关信息[71]。
Swiss Target Prediction是一个线上平台，2014年上线，旨在预测小分子中最可能的蛋白质目标。其预测是基于相似原则，通过搜索2D和3D的相似分子来实现反向筛选，这些分子的数量更大，有376342种化合物[72]。
本实验利用Pubchem和Swiss Target Prediction两种线上平台筛选和预测双硫仑及藤黄抗肿瘤主要活性成分藤黄酸在体内的药物作用靶点。
药学论文参考
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结论
本研究以双硫仑和藤黄两种药物作为抗肠癌肝转移药物组合物，对双硫仑与藤黄联用抑制肠癌肝转移的体内、体外活性和体内代谢过程进行了研究和评价，研究结论如下：
1．双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体外活性研究
采用MTT法和细胞划痕（修复）法进行体外细胞实验测定双硫仑联合藤黄对肿瘤细胞的抑制作用。根据结果推测双硫仑与藤黄联用能够抑制肿瘤细胞的生长和迁移，体外抗肿瘤活性优于双硫仑和藤黄单一用药，且随着用药时间的延长，药物的药效逐渐增强。
2．双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体内活性研究
采用脾脏种植小鼠肠癌细胞CT26.WT的方法建立BALB/c小鼠肠癌肝转移模型，研究双硫仑与藤黄联用抑制肠癌肝转移的体内抗肿瘤活性。抗肠癌肝转移体内活性研究中：
（1）模型小鼠体重变化：给药组小鼠体重增长速度比阴性对照组缓慢，双硫仑联合藤黄组小鼠造模前后体重变化不明显，卡培他滨组（阳性对照）小鼠造模前后体重有所降低，根据结果推测：双硫仑联合藤黄组与阳性药物卡培他滨相比毒性相对较小。
（2）根据模型小鼠平均生存期结果推测双硫仑联合藤黄组与双硫仑和藤黄单一给药组相比，模型小鼠的平均生存期均有所延长，且具有显著性差异，而与阳性对照组相比无显著性差异（n=6, *P<0.05, **P<0.01）。
（3）药物肿瘤抑制率与协同作用测定：给药组的平均肝重都小于阴性对照组，双硫仑联合藤黄组的平均肝重小于双硫仑和藤黄单一用药组，且具有显著性差异，而与卡培他滨组（阳性对照）相比无明显差异（n=6, *P<0.05, **P<0.01）；双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和卡培他滨组的肿瘤抑制率分别为16.38%、27.87%、47.41%和44.41%；经过金氏公式测定q=1.19，说明双硫仑与藤黄联用抑制肠癌肝转移产生了协同作用。
（4）HE染色肝脏病理观察：模型小鼠肝脏分布了大小不等的灰白色肿瘤结节，对肝脏组织进行HE染色病理切片分析，阴性对照组肿瘤病灶数量较多，肿瘤细胞DNA复制较为活跃，双硫仑组、藤黄组和双硫仑联合藤黄组肿瘤病灶数量依次减少，阳性对照组癌细胞分布最为疏松，推测双硫仑与藤黄联用抑制肠癌肝转移具有良好效果。
参考文献（略）