第 1 章 绪 论
糖尿病危害极大，可以引起多系统损害，其中包括糖尿病的心肌损害，糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）在糖尿病患者中非常常见，文献报道其发生率高达 75%[16]，糖尿病心肌病早期发病隐袭，甚至无症状，所以早期诊断非常困难，DCM 的早期干预，尽早预防对于延缓 DCM 的发病进展，以及降低DCM的致死率有非常重要的价值。DCM的概念最早于1972年由Rubler等[17]发现，自此以后 DCM 才作为一种重要的心肌病为大家所认识，DCM 的发病机制一直以来是学者研究的热点问题，但目前其具体发病机制仍然不完全清楚，近几年来，有研究指出[18] [19, 20],氧化应激可能与 DCM 发生发展有密切关系。内质网应激启动的凋亡途径是新近发现的一种凋亡途径，ERS 在糖尿病心肌病发生过程中的作用已经成为目前很多学者研究的热点问题，它与已知的死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径不同[7]。长期持续高糖状态可以导致氧化应激、血管醛固酮系统激活、脂质代谢紊乱，进而导致内质网应激的过度激活，已有研究表明糖尿病病人心肌细胞内的内质网结构发生改变，预示着糖尿病患者心肌细胞的内质网可能出现了功能紊乱[15, 21]。当外界应激状态持续存在时，细胞大量表达 GRP78 蛋白，后者的大量聚集可以激活三条内质网应激相关的凋亡通路：CHOP 途径；JNK 途径和 Caspase-12 途径。
人参皂苷 Rg1 是从人参中提取出来的一种重要活性物质，具有很广泛的药理活性。人们对人参皂苷 Rg1 的研究源于其抗心律失常的作用[22]，Zhang ZL 等[10]使用 H9C2 细胞的缺氧复氧模型，观察人参皂苷 Rg1 对心肌细胞自噬的影响，发现 100μmol/L 人参皂苷 Rg1 可以抑制缺氧复氧引起的自噬及细胞凋亡。Li X 等[11]研究缺血再灌注大鼠心肌发现，人参皂苷 Rg1 可以减轻 I/R 心肌细胞钙超载，降低 MDA、SOD，故推测其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用是通过抑制氧化应激实现的。2012 年 Luo FC 等研究发现[23]，人参皂苷 Rg1 对甲醛诱导的 PC12 神经细胞内质网应激有抑制作用，从而抑制细胞凋亡。综上，人参皂苷 Rg1 对心血管系统有广泛的保护作用，其机制涉及抑制细胞凋亡、氧化应激等。
本研究应用人参皂苷 Rg1 干预链脲佐菌素（streptozoci，STZ）诱导的糖尿病大鼠，3 个月后通过心肌组织结构和功能的变化来观察高糖所致的心肌损伤的特点，通过观察氧化应激相关指标的变化，探讨人参皂苷 Rg1 对糖尿病心脏组织氧化损伤的作用，同时通过免疫组织化学法、Western-blot 等方法，观察 GRP78、CHOP、Cleaved Caspase-l2、CASP3、Bcl-xl 蛋白表达情况，为人参皂苷 Rg1 预防高糖所致的心肌损伤提供理论依据。
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第 2 章 文献综述
2.1 综述 1 糖尿病心肌病研究进展
随着疾病进展，逐渐出现心脏收缩功能障碍，到疾病末期可以出现心力衰竭甚至死亡；糖尿病心肌病的病理结构改变主要表现为细胞凋亡、心肌肥厚、心肌组织纤维化、心肌细胞坏死等等[24]。有多种因素可以导致糖尿病心肌病的发生，包括持续高血糖，脂质代谢异常、钙离子的稳态失调，RAAS系统激活、线粒体功能障碍、活性氧蔟的增加[25]、AGEs（胞内糖基化终产物）增多等多种因素[26]。
2.1.1 代谢功能障碍
2.1.1.1 糖代谢异常
心脏收缩需要消耗大量的ATP。生理情况下，ATP的主要来源包括：葡萄糖的无氧酵解（约占5~10%）、葡萄糖的充分氧化（20~35%）及游离脂肪酸（FFA）氧化（60~70%）[27]。其中糖氧化是最有效的供能方式，脂肪酸氧化供能效率较低。当糖尿病发生时，胰岛素分泌不足或胰岛素利用障碍，虽然存在高血糖状态，但心脏对葡萄糖的利用和摄取障碍，这时，脂肪酸的利用大幅度增加[28]。葡萄糖摄取和利用障碍的原因可能有以下两各方面：1.葡萄糖转运蛋白（Glucose Transporter，GLUT）表达降低，GLUT的表达对于糖尿病大鼠心脏功能及代谢的稳定具有重要作用，由于糖利用降低以及FFA的利用增加，从而导致葡萄糖转运蛋白表达减少，葡萄糖转运至心肌细胞内减少，最终导致心肌细胞糖利用降低，而胰岛素治疗可以逆转上述病理生理改变[28]。2.糖尿病病人体内存在胰岛素减少，脂肪氧化增加，FFA的分解也明显增加，从而导致丙酮酸脱氢酶复合物的脂肪酸氧化活性降低，最终使葡萄糖的有氧氧化减少[29-31]。
2.1.1.2 脂质代谢异常
当糖尿病发生时，心肌组织对葡萄糖的摄取和利用下降，葡萄糖氧化功能明显减少，心肌收缩的能量主要来源于脂肪氧化，脂质氧化过程中需要消耗大量氧，同时脂质代谢中间产物可以导致心肌组织结构功能损害，游离脂肪酸能够抑制抑制丙酮酸脱氢酶，从而导致糖酵解中间产物和神经酰胺的堆积，加剧心肌细胞凋亡。有研究表明[32]，FFA升高可以通过毒性中间代谢产物机制诱导细胞凋亡。在糖尿病病体内，FFA水平明显增加，FFA可以导致糖尿病患者一系列病理生理改变，包括以下两点；1.随着FFA的升高，糖尿病病人体内葡萄糖氧化明显降低，糖利用减少，2.FFA水平升高可以导致FFA氧化功能时对氧的消耗增加，进而导致毒性代谢中间产物增多，从而导致糖尿病心脏结构和功能异常[33]。
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2.2 综述 2 糖尿病心肌病与内质网应激
随着人们生活水平的提高，罹患糖尿病的病人逐年增长，糖尿病并发症已经成为威胁人类健康的重要医疗卫生问题。糖尿病心肌病是糖尿病慢性并发症之一，是糖尿病患者死亡的主要原因[97]，糖尿病心肌病早期无特殊症状，临床表现隐袭，容易被忽视，临床上糖尿病心肌病首先出现心肌舒张功能障碍，再逐渐出现收缩功能不全，但早期发现困难。糖尿病心肌病的心肌存在大量细胞凋亡及心肌坏死，最终出现心肌纤维化，在该病发病早期就会出现上述表现[92, 93, 95]。关于细胞凋亡在糖尿病心肌病的作用机制的研究一直是研究热点，已有大量研究表明，细胞凋亡在糖尿病心肌病的发生、发展过程中具有重要作用。在糖尿病状态下，有很多因素可以导致细胞凋亡的发生，例如：活性氧簇增加、心肌炎症、RAAS系统激活、糖脂毒性等等[115-118]，但其具体发生机制以及可能涉及的信号转导通路尚不清楚。内质网应激介导的细胞凋亡途径是新近发现一种凋亡途径[7]，ERS介导细胞凋亡在DCM发生、发展过程中的作用已经成为目前研究的热点。
2.2.1 细胞对内质网应激的起始阶段-UPR：
内质网在细胞内广泛存在，是细胞的重要组成部分，内质网可以分为两种：粗面内质网和滑面内质网。内质网在细胞维持正常生理功能中起到重要作用，是蛋白折叠、脂质物质合成的主要场所[119, 120]。当内质网正常功能受到影响时，例如：高血糖、活性氧增加、严重感染、乏氧、缺血、毒性物质等作用下，蛋白质在折叠过程中受到干扰，会出现大量错误折叠的蛋白质，从而导致大量蛋白质聚集，内质网亡的正常生理功能无法进行，内质网的内环境稳态遭到破坏，这种状态被称为内质网应激[121, 122]。在ERS发生早期，内质网可以启动未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）来加速未折叠以及错误折叠蛋白的处理，从而逐渐恢复正常细胞生理功能，并抑制细胞凋亡和坏死发生。UPR通过以下三个途径加快错误折叠蛋白质的降解：内质网膜上的肌醇需求激酶-1（Ino sitol-requiring protein-1，IRE1）、PKR样内质网激酶（ProteinKinaser-like ER Kinase，PERK）、激活转录因子6（Activating Transcription Factor-6，ATF-6）。见图2.1。
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第3章 糖尿病大鼠模型的建立及人参皂苷RG1对糖尿病大鼠糖脂代谢以及氧化应激的影响.....19
3.1 材料和方法 .................................................................... 19
3.1.1 主要仪器、试剂 ............................................................ 19
第 4 章 人参皂苷RG1对糖尿病大鼠心脏功能及结构的影响.......................31
4.1 材料和方法 .......................................................... 31
4.1.1 主要仪器、试剂 ........................................................ 31
第 5 章 人参皂苷 RG1 对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响.....................41
5.1 主要仪器、试剂 ............................................................ 41
5.1.1 主要仪器............................................................ 41
第5章 人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响
上一章的研究结果表明，人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠心脏功能及结构有明显影响，且根据Tunel结果提示人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠的保护作用与抑制细胞凋亡有关，为明确其抑制细胞凋亡的分子机制，展开本章研究。
5.1 主要仪器、试剂
5.1.1 主要仪器
-20 冰箱 SIEMENS-80
冰箱 SIEMENS
50μL 微量进样器 50μL 微量进样器
半自动切片机（RM2145） 德国 LELCA 公司
全自动包埋机（EG1160） 德国 LELCA 公司
移液器 德国 Eppendorf Easypet 公司
电热鼓风干燥箱（BHW2-Ⅰ） 上海市实验仪器总厂
显微镜（BX-51） 日本奥林巴斯公司
数码成像系统（DP71） 日本奥林巴斯公司
蛋白凝胶成像系统 日本奥林巴斯公司
全温振荡器（DKZ-3） 上海一恒
脱色摇床（WD-9405A） 上海化科实验器材有限公司
台式超速冷冻离心机（Beckman） 美国伯乐
扫描分光光度计（6505 ov/vis） 英国 JANWAYSDS-PAGE
垂直电泳仪 美国 Bio-Rad 公司
标准湿式转膜装置 美国伯乐湿盒 上海化科实验器材有限公司
染色缸 海门市盛泰实验器材厂
DHP-9032 电热恒温培养箱 上海攸茜实业有限公司
不锈钢高压锅 北京华夏远洋科技有限公司
硝酸纤维素膜 碧云天生物技术有限公司（上海）
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第 6 章 结 论
6.1 结论
本研究中，我们通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ，40mg/kg）成功制备大鼠糖尿病模型，通过HE染色及Masson染色行组织学检查发现糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂以及间质纤维化。使用多普勒超声检查发现糖尿病大鼠心肌肥厚及心脏收缩及舒张功能障碍。Tunel法检测发现糖尿病大鼠心肌存在细胞凋亡，更重要的是该实验发现人参皂苷Rg1能够减轻糖尿病大鼠心肌组织结构紊乱，增加心脏功能，同时能够减轻氧化应激及细胞凋亡。糖尿病心肌病的发病机制非常复杂[188, 189, 191-197]，高血糖所致的细胞凋亡是糖尿病心肌病一个重要的发病机制[193]。糖尿病发生后，有很多因素可以导致内质网应激的发生，例如缺血、氧化应激、缺氧、高血糖、高血脂等等，其中持续高血糖是引起内质网应激的最重要因素[137, 198]。内质网应激在细胞内环境稳态中有重要作用，过度及长时间的ERS能够导致细胞凋亡[150]。GRP78蛋白是内质网应激发生的标志分子，内质网应激相关的细胞凋亡途径涉主要有CHOP，Caspase12以及JNK通路。其中Caspase12和CHOP凋亡通路是内质网应激所特有。
有研究显示人参皂苷Rg1可以减轻心肌肥厚及改善心脏功能[13]，保护大鼠心肌细胞免于缺血再灌注损伤[12, 199]，延长犬心室不应期[159]，减轻高血糖所致的心肌肥厚[200]。人参皂苷Rg1的心脏保护作用涉及到抗凋亡、抗氧化应激、抗内质网应激等等[201]。人参皂苷Rg1除减轻糖尿病大鼠心肌内质网应激所致的细胞凋亡外，还可以抑制神经元细胞[202]、淋巴细胞[203]、PC12细胞[204, 205]、人内皮细胞[206]及Jurkat细胞凋亡[207]。总之,人参皂苷Rg1的抗凋亡作用是其发挥心脏保护作用的最重要方面。GRP78 又称免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin binding protein），是内质网中一种伴侣蛋白，对内质网应激起着重要的保护反应，其通过稳定细胞内质网功能，保持细胞内环境稳态，被认为是内质网应激信号系统上游的开关分子[208, 209]，在内质网适应阶段，未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）被激活[210]，后者可以保护细胞免受 ERS 所引起的细胞损伤，恢复细胞正常生理功能，UPR 通过三个通路介导对细胞的保护作用，分别是 PERK，ATF 和 IRE-1。
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参考文献（略）