第 1 章 引 言
尽管采用放疗、手术及化疗的综合序贯治疗，舌鳞癌患者的五年生存率并未显著提高，且化疗带来的耐药现象严重影响了患者的预后[2, 3]。在舌鳞癌发生、发展、侵袭、转移及复发过程中，细胞水平及亚细胞水平上存在大量异常的生物学现象，这些生物学现象包括细胞存活、细胞死亡、细胞侵袭、癌基因的激活、抑癌基因的失活以及相关信号通路的异常调节[4]。传统中草药在肿瘤治疗中的作用越来越重要，白花丹素（2-甲基-5-羟基-1,4 萘醌，C11H8O3）（Plumbagin, PLB）是一种具有生物学活性的萘醌类化合物，其药理学功能较广泛，体内外研究表明其具有抗炎、神经保护、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗菌等作用[5]，早在 1980 年，Krishnaswamy 等人的研究表明白花丹素可有效抑制体内淋巴细胞瘤白血病的生长，并得到其半数有效量为 0.75mg/kg[6]。1984 年Wurm 等人发现白花丹素是白花丹植物抗肿瘤的主要物质基础[7]。2003 年 Lin 等人的研究发现白花丹素能显著抑制 Raji、Calu-1、HeLa 和 Wish 肿瘤细胞的增殖和生长[8]。然而，白花丹素对舌鳞癌细胞的杀伤、化疗增敏作用及其分子机制仍未明晰。我们团队的前期研究发现白花丹素能够通过线粒体依赖途径诱导舌鳞癌 Tca8113 细胞凋亡[9]。
在本研究中，我们首先通过 SILAC 定量蛋白质组学技术研究了舌鳞癌细胞SCC25 和 CAL27 经白花丹素作用后细胞内全组蛋白分子及相关信号通路的改变。随后应用一系列分子生物检测手段，验证了 SILAC 定量蛋白质组学结果。最后研究了白花丹素对舌鳞癌基础化疗药物顺铂的增敏作用及其机制。
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第 2 章 白花丹素作用后舌鳞癌细胞内全组蛋白及信号通路的改变
白花丹素是从白花丹植物根茎中提取的萘醌类化合物，具有抗细菌[12]、抗真菌[13]、抗动脉粥样硬化[14]及抗肿瘤[15]等作用。舌鳞癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，具有浸润生长和早期转移的特征[3]。为了系统了解白花丹素作用于舌鳞癌细胞后细胞内全组蛋白和信号通路的改变，本章实验采用 SILAC 定量蛋白质组学技术率先进行研究，旨在全面揭示白花丹素作用于舌鳞癌细胞的可能分子靶标，为随后的生物功能分析及验证实验提供依据。
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.1.1 细胞系
人舌鳞癌细胞 SCC25、CAL27 和人牙龈成纤维细胞 HGF-1 均购自美国ATCC 公司。SCC25 细胞培养在含 1.2 g/L 的碳酸氢钠、2.5 mM 左旋谷酰胺、15mM 羟乙基哌嗪乙磺酸、0.5 mM 丙酮酸钠、400 ng/mL 氢化可的松以及 10%热灭活 FBS 的 DMEM/F12 培养基中。CAL27 和 HGF-1 细胞培养在含酚红、4 mM左旋谷酰胺、4.5g/L 葡萄糖、1mM 丙酮酸钠、1.5g/L 碳酸氢钠以及 10%热灭活FBS 的 DMEM 培养基中。SCC25、CAL27 和 HGF-1 细胞均置于 37oC、5% CO2、95%空气条件下的细胞培养箱中进行培养，收集对数生长期细胞用于实验。
2.1.1.2 主要仪器设备
可调试移液器 Eppendorf 公司，德国
96 孔板 Corning 公司，美国
试剂加样槽 (100ml) Thermoscientific 公司，美国
4℃ 冰箱 Thermoscientific 公司，美国
-20℃ 低温冰箱 Thermoscientific 公司，美国
-80℃ 超低温冰箱 Thermoscientific 公司，美国
液氮罐 Thermoscientific 公司，美国
CO2细胞培养箱 Thermoscientific 公司，美国
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2.2 结 果
2.2.1 白花丹素对舌鳞癌细胞及正常牙龈成纤维细胞的半数抑制浓度
为了探讨白花丹素的安全性及有效工作浓度，本部分采用 MTT 法检测白花丹素对舌鳞癌细胞 SCC25、CAL27 及正常牙龈成纤维细胞 HGF-1 的半数抑制浓度 IC50，分别将不同浓度的白花丹素作用于 SCC25、CAL27 和 HGF-1 细胞 12、24、48 和 72 hr 后，根据增殖存活曲线得出相应的 IC50。其中SCC25细胞经白花丹素作用12、24、48和72 hr后得到的IC50分别为14.8、8.4、7.4、4.3 μM，CAL27细胞经白花丹素作用 12、24、48 和 72 hr 后得到的 IC50分别为 8.7、3.1、2.2、1.2 μM，HGF-1 细胞经白花丹素作用 12、24、48 和 72 hr 后得到的 IC50分别为35.7、29.9、17.4、8.1 μM（图 2.1）。白花丹素作用 24 hr 后，舌鳞癌 SCC25 和 CAL27 细胞的IC50平均值为5.8μM，而人正常牙龈成纤维细胞的 IC50为29.9μM，因此在24hr 时间节点上白花丹素对舌鳞癌细胞毒性选择指数 SI 值为 IC50(HGF-1)/IC50(TSCC)=5.2；白花丹素作用 48 hr 后，舌鳞癌 SCC25 和 CAL27 细胞的 IC50平均值为 4.8 μM，而人正常牙龈成纤维细胞的 IC50为 17.4 μM，因此在 48 hr 时间节点上白花丹素对舌鳞癌细胞的 SI 值为 3.6，无论是在 24hr 还是 48hr 时间节点上，白花丹素均能高效杀伤舌鳞癌 SCC25 和 CAL27 细胞，而对正常牙龈成纤维细胞 HGF-1 杀伤作用不明显，提示白花丹素可做为一种高效低毒的抗舌鳞癌药物。
2.2.2 白花丹素作用后舌鳞癌细胞内全组蛋白及信号通路的改变
2.2.2.1 白花丹素作用于 SCC25 和 CAL27 细胞后 SILAC 定量蛋白质组学结果总体情况
我们采用 SILAC 定量蛋白质组学来分析对比白花丹素对 SCC25 和 CAL27细胞的分子作用机制。根据白花丹素对 SCC25 和 CAL27 细胞的 IC50，我们选用5 μM、1 μM 的白花丹素分别作用于 SCC25 细胞、CAL27 细胞 24 hr，随后进行定量蛋白质组学分析。经鉴定分析白花丹素作用于 SCC25 和 CAL27 细胞后分别有 398 和 354 种蛋白分子受到调控，这些蛋白分子可参与细胞增殖、代谢、侵袭、转移、存活和死亡，如 CDK1/CDC2、MAPK、mTOR、PI3K、Akt 以及E-cadherin。在 SCC25 细胞中，白花丹素可上调 143 种蛋白分子并下调 255 种蛋白分子；而在 CAL27 细胞中，白花丹素可上调 117 种蛋白分子并下调 237 种蛋白分子。采用 IPA 软件分析得出白花丹素可引起 SCC25 细胞中 101 条信号通路的改变及 CAL27 细胞中 100 条信号通路的改变，其中在影响最为明显的十条信号通路中，白花丹素可共同调控 SCC25 和 CAL27 细胞中 mTOR 信号通路、Nrf2介导的氧化应激反应及上皮粘附重塑反应（表 2.1、2.2）。
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第 3 章 白花丹素诱导舌鳞癌细胞周期阻滞、凋亡与自噬的作用及机制..........15
3.1 材料与方法 ............................................................15
3.1.1 实验材料 ........................................................15
第 4 章 白花丹素抑制舌鳞癌细胞上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性的作用及机制........58
4.1 材料与方法 ......................................................58
4.1.1 实验材料 ........................................................58
第 5 章 白花丹素对舌鳞癌细胞顺铂化疗增敏的作用及机制...............94
5.1 材料与方法 .....................................................94
5.1.1 实验材料 ......................................................94
第 5 章 白花丹素对舌鳞癌细胞顺铂化疗增敏的作用及机制
根据前面三章研究得知：白花丹素对舌鳞癌 SCC25 和 CAL27 细胞具有诱导G2/M 期阻滞、诱导细胞凋亡与自噬、抑制上皮细胞间质转化及干细胞样特性的作用，且 PI3K/Akt/mTOR、p38 MAPK/Nrf2 信号通路参与了以上生物学过程的调节。白花丹素是一种有效杀伤舌鳞癌的中草药，然而其对舌鳞癌细胞顺铂化疗增敏作用尚不清楚，为此，本章研究将重点探讨白花丹素对舌鳞癌细胞顺铂化疗增敏作用及其机制。
5.1 材料与方法
5.1.1 实验材料
5.1.1.1 细胞系
人舌鳞癌 SCC25 和 CAL27 细胞均购自美国 ATCC 公司。SCC25 细胞培养在含 1.2 g/L 的碳酸氢钠、2.5 mM 左旋谷酰胺、15 mM 羟乙基哌嗪乙磺酸、0.5 mM 丙酮酸钠、400 ng/mL 氢化可的松以及 10%热灭活 FBS 的 DMEM/F12 培养基中。CAL27 细胞培养在含酚红、4 mM 左旋谷酰胺、4.5 g/L 葡萄糖、1 mM丙酮酸钠、1.5g/L 碳酸氢钠以及 10%热灭活 FBS 的 DMEM 培养基中。SCC25、CAL27 细胞均置于 37oC、5% CO2、95%空气条件下的细胞培养箱中进行培养，收集对数生长期细胞用于实验。
5.1.1.2 主要仪器设备
可调试移液器 Eppendorf 公司，德国
96 孔板 Corning 公司，美国
8 孔玻片培养皿 Thermoscientific 公司，美国
试剂加样槽 (100ml) Thermoscientific 公司，美国
4℃ 冰箱 Thermoscientific 公司，美国
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第 6 章 结论与展望
6.1 结 论
（1）白花丹素能够有效抑制舌鳞癌细胞的增殖活性，而不影响正常牙龈成纤维细胞的增殖；SILAC 定量蛋白质组学技术全面揭示了白花丹素作用于舌鳞癌细胞 SCC25 和 CAL27 后细胞内全组蛋白分子及信号通路的改变，白花丹素能够广泛调控舌鳞癌细胞的细胞周期、凋亡、自噬、上皮间质转化及氧化还原状态。
（2）白花丹素能够以浓度/时间依赖的方式抑制舌鳞癌细胞集落形成并且诱导舌鳞癌细胞 G2/M 期阻滞；白花丹素能够通过抑制 PI3K/Akt/mTOR 及 p38 MAPK信号通路诱导舌鳞癌细胞凋亡与自噬；白花丹素诱导的舌鳞癌细胞凋亡与自噬之间存在相互促进作用。
（3）白花丹素通过抑制 p38MAPK/Nrf2 信号通路诱导舌鳞癌细胞产生大量活性氧；白花丹素能够显著抑制舌鳞癌细胞上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性；白花丹素诱导的活性氧参与调控舌鳞癌细胞 G2/M 期阻滞、诱导细胞凋亡与自噬并抑制上皮间质转化及肿瘤干细胞样特性。
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参考文献（略）