第一章 前言
1.1 膀胱癌概述
膀胱癌作为一种常见的恶性肿瘤严重威胁着人类健康，且近几十年来随着人们不良生活方式多样化的改变、空气污染的加重、以及越来越多的接触化学性致癌物质，患膀胱癌的人数在逐年增多[1,2]。Torre 等人对全球人群最新统计出来的数据显示：膀胱癌在所有癌症中是第九位最常见的恶性肿瘤，在男性中的发病率已占男性肿瘤发生的第六位，其致死率在所有癌症死亡原因中排第 13 位[3]。在一些发达国家中膀胱癌的发生发展趋势也不宜乐观，据美国癌症协会数据统计，2015 年时在全部美国人群中有大约 74000 人被诊断为膀胱癌，在这些膀胱癌患者中因肿瘤本身死亡的人数将近 16000 人，在所有死亡病例中男性患者为女性患者的 3 倍，这种患病率和死亡率的差异可能与男性的吸烟习惯、职业特点、生活压力、及性激素水平等因素有关[4,5]。我国膀胱癌的发病率与西方发达国家稍有不同，2012 年一项关于我国膀胱癌发生发展的数据统计显示：膀胱癌总发病率为 6.69/10 万, 在男性中占第八位，在女性中排名第十二位以后，总死亡率为2.53/10 万[6]。我国膀胱癌目前的发病率总体低于西方国家，但关于我国城市肿瘤发病率报告以及近些年膀胱癌发生发展调研数据均显示近年来我国膀胱癌发病率有逐年上升趋势[6,7]。关于膀胱癌发生的病因比较复杂，是多种因素作用下发生的多步骤的过程，如遗传、免疫、环境等等，因此目前尚无确切的机制来阐述所有膀胱癌病例的发生。膀胱癌按照肿瘤细胞侵袭的不同层次可分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscleinvasive bladder cancer, MIBC）。其中，非肌层浸润性膀胱癌的发病率为 70%左右，相对肌层浸润性膀胱癌来讲，非肌层浸润性膀胱癌的治疗、长期生存率以及预后等都较为乐观，但是在非肌层浸润性膀胱癌发生发展过程中，约有 15%的非浸润性肿瘤可发展为肌层浸润性膀胱癌[8]。膀胱癌的治疗方法较为多样，首先是根据上述方法对膀胱癌进行分型，然后再根据不同的肿瘤类型选择相应的治疗手段。对于局限性的无远处转移的膀胱癌，临床上主要采取的治疗方法是根治性切除治疗，一般来讲对这种肿瘤采取手术治疗后预后好、对病人生活质量影响不大；非肌层浸润性膀胱癌的治疗与局限性膀胱癌相比较为麻烦，首先对部分易于手术的肿瘤组织行经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）以切除，术后尚需要根据病检结果判断肿瘤分期和分级辅助一些其他治疗手段；肌层浸润性膀胱癌的治疗最为麻烦，手术之前根据病人整体情况行局部或者全身的新辅助化疗，行根治性膀胱切除术后一般尚需辅助一些其他治疗手段以提高疗效。
..........
1.2 膀胱癌的基因治疗
基因治疗是针对各种恶性肿瘤治疗的最有希望的策略之一，用于调节遗传状态的各种基因治疗策略已经应用于膀胱癌治疗，并且已经在体外和体内试验中得到了证实。随着分子生物学及其相关科学的发展，膀胱癌的基因治疗也朝着更加多样化的方向发展。基于组织病理学和分子生物学的研究已经证实基因的改变与膀胱癌的发展和进展密切相关，且这些遗传的改变在膀胱癌发病机理中的作用以及与膀胱癌临床特征的关系逐渐被证明。从膀胱癌的发病机制来讲，这些遗传改变主要包括两种基因：一种是激活加速癌症生长的基因：致癌基因（ras, fos, myc, erbB-2,CCND1），生长因子（EGF, EGFR），血管生成因子（VEGF, bFGF），抗细胞凋亡因子（bcl-2, survivin），细胞周期刺激因子（Cox-2）等；另一种是失活抑制细胞增殖的基因：肿瘤抑制基因（p53, p21, PTEN,ARF, CDKN2A），细胞周期抑制剂（p16, TRAIL, Rb），凋亡基因（bax, Fas, gelsolin, TNF），细胞黏附分子（ICAM-1,CCAM-1, CAR）等[11,12]。致癌基因 ras 最初被认定为膀胱癌发生的转化基因，突变的 ras 致癌基因激活下游蛋白的表达并导致调节基因的转录因子发生不受控制的磷酸化。一旦 Ras蛋白被激活，它将失去恢复其无活性形式的能力，并继续刺激膀胱上皮细胞发生无限增殖[13,14]。致癌基因 fos 也称为转录因子，是一种刺激细胞外有丝分裂的早期反应基因。fos 蛋白与 jun 形成的复合物可以在活化蛋白位点上调节多种基因的转录激活，且在信号转导和刺激膀胱上皮细胞分化中起了关键作用[15]。血管生成的过程与膀胱癌的发病机制密切相关，膀胱癌的发生过程中生成的血管的性质与肿瘤的侵袭性和转移性有千丝万缕的联系。环氧合酶-2（Cox-2）是一种前列腺素催化酶，与上皮癌发生中各环节的启动和癌症的进展有关系。有研究表明在膀胱癌中 Cox-2 的表达明显增加，且与膀胱癌的进展相关[16,17]。各种肿瘤抑制基因的异常表达也与膀胱癌的发生和疾病的进展相关。据报道 p53 功能的改变在膀胱癌的多步进展中均起到重要作用，而 50％的膀胱癌患者可发生 p53 基因表达的改变，p53 的失活不仅可以通过遗传改变导致膀胱癌的发生，还可以通过结合细胞因子如 mdm2 或 by 等改变蛋白质的亚细胞定位[18]。总之，各种不同的致癌基因或者抑癌基因分别在膀胱癌的发生发展中起着重要的作用。
..........
第二章 嵌合型不依赖于 CAR 的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 的构建、纯化及鉴定
我们课题组运用分子生物学技术通过制作多克隆位点接头及限制性内切酶法构建了以 PSCAE 为增强子、UPⅡ为启动子及 E1A 目的基因的穿梭质粒Rp-PSCAE-UPⅡ-E1A，见图 2-1。在前期的工作中我们应用该穿梭质粒与传统 5型腺病毒 Ad5 骨架质粒同源重组形成重组质粒，然后通过 pAdEasy-1 系统构建出了具有膀胱癌组织特异性的溶瘤腺病毒 Ad5-PSCAE-UPⅡ-E1A。我们课题组具有构建膀胱癌组织特异性溶瘤腺病毒的平台，并熟练掌握病毒构建的相关技术。本课题中利用包含 11p 型腺病毒纤毛的轴区及旋钮区和 5 型纤毛尾区的骨架质粒 Ad5/F11（p见图 2-2）与穿梭质粒 Rp-PSCAE-UPII-E1A 在大肠杆菌 BJ5183中同源重组产生嵌合型重组腺病毒质粒 pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。根据pAdEasy-1 系统，在 HEK293 细胞中包装重组质粒，构建出不依赖于 CAR 的膀胱癌细胞特异结合的嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。将得到的重组腺病毒在 HEK293 中扩增，收集后进行纯化。在嵌合型病毒的构建过程中分别用限制性内切酶法和普通 PCR 法对嵌合型病毒质粒和病毒基因中 E1A、UPⅡ及 PSCAE 这三种基因进行检测，验证嵌合型不依赖于 CAR 的腺病毒构建的成功。下一步用经典 TCID50 （50% Tissue Culture Infective Dose，50% 组织培养感染病毒的剂量）法测定我们收集的嵌合型腺病毒的滴度。腺病毒的成功构建为后续研究该种不依赖于 CAR 的新型嵌合型膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用提供理论基础。
2.1 实验材料
2.1.1 质粒、细菌菌株和细胞株
（1）本课题中所用的腺病毒骨架质粒 Ad5/F11p 由北京军事医学科学院王立生教授馈赠；实验用到的穿梭质粒 Rp-PSCAE-UPII-E1A 和传统的 5 型溶瘤腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A 为本课题组前期构建并保存于兰大二院泌研所。（2）实验中用到的两种大肠杆菌 BJ5183 和 DH-5α 为本实验室购买并保存。（3）人胚肾 HEK293 细胞为本实验室购于美国典型培养物储藏中心（AmericanType Culture Collection），保存于本实验室。
..........
2.2 实验方法
（1）腺病毒构建的研究中主要使用的细胞株是 HEK293 细胞，HEK293 细胞培养需高糖 DMEM 培养基。（2）从细胞保存液氮罐中取出病毒包装时需用的 HEK293 细胞，把整个冻存管置于 37～40℃水浴环境中进行复苏，不停的轻微晃动冻存管尽量在 1min 内使冻存管内的液体完全溶解。然后用新洁儿灭尽可能完全的擦拭冻存管外部后在无菌超净台内用加样枪轻轻吹打冻存管内液体并转移至 15ml 离心管内，800rpm 离心 5min，弃掉上清，再离心管内加入 5ml 细胞培养液重悬沉淀，重悬时可轻轻吹打以避免出现大量的细胞团块，然后转至 25cm2细胞培养瓶，把培养瓶放入含有 5% CO2浓度的温箱中培养。（3）轻轻的取出细胞培养瓶肉眼观察瓶内细胞培养液颜色及清亮度，以初步判断瓶内液体是否有细菌或者真菌污染，然后在显微镜下观察 HEK293 细胞的生长情况、形态、瓶内污染情况等。HEK293 细胞属于贴壁生长细胞，但是该细胞贴壁不牢靠容易漂浮，因而在对该细胞进行任何操作时均需轻拿轻放，切忌大幅度晃动培养瓶。（4）细胞的换液和传代均在无菌操作台内进行。操作之前把需要的 PBS 溶液、0.25%胰酶和培养基从冰箱取出室温放置一段时间，避免冰箱中取出的试剂直接进行细胞培养。换液时首先倒掉原有细胞培养液，加入 2 ml PBS 缓冲液洗涤培养瓶内残留的培养液，然后再补充新的细胞培养液约 6ml 继续置于 CO2细胞培养箱中培养。
.........
第三章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对膀胱癌细胞的体外抗肿瘤作用研究 ...... 38
3.1 实验材料 ........... 38
3.2 实验方法 ........... 42
3.3 实验结果 ........... 49
3.4 讨论 ..... 623.5 结论 ..... 65
第四章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞的体外抗肿瘤作用研究 ........ 66
4.1 实验材料 ........... 66
4.2 实验方法 ........... 68
4.3 实验结果 ........... 70
4.3.1 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞抗增殖作用...........70
4.3.2 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞凋亡的影响...........73
4.3.3 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞凋亡相关分子的影响.....74
4.4 讨论 ..... 76
4.5 结论 ..... 79
第四章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 联合顺铂对膀胱癌细胞的体外抗肿瘤作用研究
顺铂（cisplatin，DDP）是一种金属铂类无机化合物，在临床上常作为细胞周期非特异性抗肿瘤药物而被应用于辅助或新辅助化疗[78]。顺铂在膀胱癌的药物治疗应用也较广泛，无论是常规辅助化疗还是新辅助化疗顺铂都是一个相对安全、有效和经济的药物。顺铂的作用特点是通过药物理化性质作用于肿瘤细胞的遗传物质使其无限复制增殖的 DNA 破坏掉，进而影响转录翻译等各个步骤[79]。尽管顺铂在膀胱癌的药物治疗中应用广泛，但是顺铂的应用也存在较为严重的不良反应和耐药性。溶瘤腺病毒和顺铂这两者治疗膀胱癌的作用机制不同，把两者联合起来不仅可以减少各自产生的不良反应，还可以起到协同作用以更大程度的发挥抗肿瘤作用。因而在本课题中我们把新构建的嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 与顺铂联合抗膀胱癌细胞5637、EJ 和 T24，探索这种新病毒和顺铂之间的相互作用以及初步探讨其联合作用机制。分别取对数生长期的人正常尿路上皮细胞株 SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞株5637、EJ 及 T24 制备单细胞悬液以 5000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，置于 CO2恒温培养箱中培养 24 h。实验用细胞分为四组：不加顺铂和病毒的阴性对照组、单用顺铂组、单用病毒 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 组以及 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 和顺铂联合组，每组设置 6 个复孔。
...........
结论
（1）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 联合顺铂对人正常尿路上皮细胞株 SV-HUC-1无杀伤作用，对 5637、EJ 及 T24 三种膀胱癌细胞有协同抗肿瘤作用。
（2）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 联合顺铂可以诱导膀胱癌细胞发生早期凋亡，上调 Fas、Bax 和 cleaved Caspase 3 基因的表达，下调 Bcl-2 基因的表达。
（3）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A 联合顺铂协同抗膀胱癌的作用机制可能是通过增强内源性和外源性凋亡途径诱导膀胱癌细胞发生凋亡。
..........
参考文献（略）