关于hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对HeLa裸鼠移植瘤生长抑制的作用

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　　　　　　　　 作者：张明 辛晓燕 李红梅 宋辉

　　【Abstract】 AIM: To study the inhibitory effect of hTERT promoter regulated TRALL combined with chemo radiotherapy on the growth of transplantation tumor of HeLa cells in nude mice. METHODS: The TRAIL gene activated by the hTERT promoter was transfected into HeLa cells; The GFP protein expression of TRAIL was examined by immunohistochemical staining;The rats were pided into TRAIL gene transfection group，chemotherapy group，radiotherapy group，combined treatment group(genetransfection + chemoradiotherapy)， and control group，with 5 rats in each group.The TRAIL gene transfected cells and the blank HeLa cells were seeded in mice subcutaneously. The combinded effects of TRAIL with chemoradiotherapy on the nodulation of the cervical cancer HeLa lines were detected. The changes of tumor weight，sizes， and the tumor growth inhibition rate were determined. RESULTS: GFP/TRAIL expression rate was significantly higher in hTERT_TRAIL transfected cells than in control cells(P&<0.01). Nodulation of HeLa cells was observed on day 57 in all group， with no difference in nodulation generation time(P&>0.05). The transplanted tumor weight was significantly different between transfected hTERTTRAIL group and control group (P&<0.05). The transplanted tumors in hTERTTRAIL grew slowly compared to control group.The tumor growth inhibition rate was 43.08% in hTERTTRAIL group and 61.63% in the gene transfection plus radiochemotherapy group at week 4 (P&<0.01). CONCLUSION: hTERTTRAIL exerts obvious inhibitory effects on the growth of HeLa cells transplanted tumor in nude mice.The gene transfection plus radiochemotherapy may enlighten the future preclinical study and clinical therapy for tumors.
　　【Keywords】 cervix neoplasms; tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL); telomerase; promoter regions (genetics); cisplatin; neoplasm transplantation; mice， nude; apoptosis
　　【摘要】　目的： 探讨hTERT启动子驱动的TRAIL联合放化疗对宫颈癌HeLa裸鼠皮下移植瘤生长抑制的作用. 方法： 将含有hTERT启动子的TRAIL基因载体转染宫颈癌细胞HeLa，检测稳定转染细胞中GFP/TRAIL的表达；实验裸鼠分为基因组，化疗组，放疗组，综合组（基因+放化疗），对照组，每组5只，未转染HeLa组为对照组，不作任何处理；将稳定转染基因载体及未转染的HeLa细胞种植于裸鼠背部皮下，联合放化疗，来观察移植瘤成瘤情况，移植瘤的体积、质量以及质量抑制率的变化. 结果： 转染hTERTTRAIL细胞中GFP/TRAIL(绿色荧光蛋白)表达率高于对照组，有统计学意义 (P&<0.01)；各组裸鼠在接种细胞第5~7日全部长出肿瘤小结节，结节出现的时间差异无统计学意义(P&>0.05)；转染hTERT TRAIL细胞与对照组HeLa细胞裸鼠的移植瘤质量相比差异有统计学意义(P&<0.05); hTERT TRAIL细胞在裸鼠体内所形成的移植瘤生长较慢， 4 wk后肿瘤质量抑制率为43.08%，联合放化疗后肿瘤质量抑制率为61.63%，有统计学意义(P&<0.01). 结论： hTERT启动子驱动的TRAIL对人宫颈癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用，联合放化疗能抑制裸鼠移植瘤的生长. 基因治疗联合放化疗等多途径综合治疗为以后的肿瘤研究和临床治疗提供思路.
　　【关键词】　宫颈肿瘤;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体; 端粒，末端转移酶；启动区（遗传学）；顺铂；肿瘤移植；小鼠，祼；细胞凋亡
　　0引言
　　
　　HTERT端粒酶启动子属于肿瘤细胞的特异性启动子［1］，对肿瘤细胞具有靶向作用. 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosisinduced ligand， TRAIL)具有选择性杀伤肿瘤细胞的作用，其抗肿瘤的优点已受到研究者的广泛重视［2］. 本实验旨在探讨端粒酶(hTERT)启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对HeLa裸鼠宫颈癌移植瘤的抑制作用，以及与化放疗的协同作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料宫颈癌细胞株HeLa由第四军医大学西京医院妇产科实验室提供，体外培养传代. 质粒hTERTpromoterpIRES2EGFP由李红梅博士惠赠. Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒、G418购自Invitrogen公司. 胎牛血清购自杭州四季青公司，DMEM购自Gibco公司. cDDP为齐鲁制药厂产品. BALB/C裸鼠5~6 wk，体质量16~18 g，购自上海金来克实验动物研究所. 第四军医大学口腔医院动物中心恒温恒湿条件下饲养，垫料饮水饲料均经过灭菌处理.
　　1.2方法
　　1.2.1HeLa细胞培养和TRAIL基因转染含100 mL/L胎牛血清的DMEM于37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养传代，倒置显微镜下观察细胞生长状况，于对数生长期时收集细胞，以5×105细胞/孔接种于6孔板，过夜培养. 待细胞长满至80%~85%板面积时，分别以hTERTpromoterpIRES2EGFPTRAIL载体， HeLa细胞，具体操作按Lipofectamine2000试剂盒说明书进行，同时以未转染的HeLa细胞为阴性对照. 转染48 h后，以含800 g/L G418的选择培养液进行筛选.
　　1.2.2转染hTERTpromoterpIRES2EGFPTRAIL细胞的免疫荧光表达G418筛选后的抗性克隆扩大培养，2.5 g/L胰酶消化，制备细胞爬片，以950 mL/L乙醇固定20 min，0.01 moL/L PBS振洗5 min，免疫荧光染色采用间接免疫荧光法检测GFP/TRAIL的表达. TRAIL mAb（1∶400），37℃孵育1 h ， FITC标记兔抗小鼠IgG 37℃ 45 min ，各步骤间用PBS(pH 7.4)充分漂洗，磷酸甘油封片，于MRC1024型激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察摄片（激发波长为488 nm，共聚焦系统由BioRad公司提供的软件控制），转染3次细胞， 利用软件在镜下随机选取5个细胞，对其进行定量分析，取平均值.
　　1.2.3接种细胞和动物分组
　　1.2.3.1分组每组5只，对照组命名HeLa1，腹腔注射PBS 0.2 mL；实验组：命名HeLaT基因组，腹腔注射PBS 0.2 mL；命名 HeLaC为化疗组，腹腔注射DDP，剂量为3 mg/kg；命名HeLaR放疗组，腹腔注射PBS 0.2 mL，放疗剂量2 Gy;命名HeLaRC为联合组，放疗剂量2 Gy ，放疗前30 min腹腔注射 cDDP 3mg/kg，放疗2次.
　　1.2.3.2接种细胞取对数生长期的转染hTERTTRAIL细胞，HeLa细胞，分别制成1×1011/L的细胞悬液0.2 mL，用0.2 mL注射器接种于6周龄BALB/C裸鼠背部皮下，上下各1点，每点0.2 mL细胞悬液，观察肿瘤生长情况.
　　1.2.3.3照射条件X射线采用美国Varian公司Clinac 600 直线加速器6 MV X射线，源皮距（SSD）100 cm，吸收剂量率250 Gy/min，射野面积6.5 cm×30 cm，照射剂量2 Gy. 采用局部照射，其他部位屏蔽. 将裸鼠固定使肿瘤暴露于照射野内，肿瘤表面覆盖1.5 cm厚蜡板以提高建成区.

　　1.2.3.4化疗腹腔注射cDDP，剂量为3 mg/kg.
　　1.2.4观察与测量定期观察裸鼠的精神饮食及排便情况. 4 wk后处死裸鼠. 测量裸鼠移植瘤的体积和瘤质量. 肿瘤体积质量的测定. 用瑞士WHB游标卡尺测量肿瘤最长径（a）和垂直方向最大横径（b），按公式V（mm3）=a×b2/2，计算肿瘤体积. 取瘤称质量， 计算抑瘤率(%)=（对照组瘤质量-实验组瘤质量）/对照组瘤质量×100%.

　　1.2.5裸鼠移植瘤中TRAIL的表达将对照组和实验组取下的瘤体经40 g/L多聚甲醛固定梯度乙醇脱水及石蜡包埋，进行连续切片，厚度4 μm，按实验SABC免疫组化法检测移植瘤中的TRAIL的表达用PBS代替一抗作为染色的阴性对照，用已知的阳性乳腺癌切片为阳性对照. 一抗TRAIL作用浓度1∶400.
　　统计学处理：采用SPSS10.0软件分析， 实验所得数据，计量资料数据用x±s表示，各组间差异比较采用方差分析;计数资料用χ2检验，P&<0.05认为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1免疫荧光TRAIL的表达情况以hTERTTRAIL转染的肿瘤细胞的细胞质中可见到特异性GFP绿色荧光蛋白的表达，说明肿瘤细胞有转录活性(图1). 载体转染成功. 转染组的TRAIL表达率为0.571±0.008，对照组为0.166±0.03，差异有统计学意义(P&<0.01).
　　2.2成瘤率及肿瘤重量的抑制率、肿瘤终体积和质量各组组平均肿瘤终体积质量如下表所示. 统计学分析表明，各组肿瘤终体积和质量均明显小于对照，有统计学意义(F=62.712，88.287， P&<0.01，表1).
　　在接种第5~7日全部长出肿瘤小结节，结节出现的时间差异无显著性意义(P&>0. 05). 转染真核表达hTERTTRAIL组细胞与对照组未转染的HeLa细胞在裸鼠体内瘤质量分别为(0.399±0.012)和( 0.701±0. 057) g 两者相比有显著差异(P&<0.05)；转染hTERTTRAIL细胞在裸鼠体内所成肿瘤生长较慢， 4 wk后肿瘤质量抑制率为43.08%，联合放化疗后肿瘤质量抑制率为61.63%，有统计学意义(P&<0.01).
　　图1转染hTERTpromoterpIRES2EGFP_TRAIL的肿瘤细胞中的TRAIL表达情况×200（略）

　　表1裸鼠皮下成瘤试验肿瘤的质量和体积（略）
　　bP&<0.01 vs对照.
　　2.3裸鼠宫颈癌移植瘤的TRAIL表达情况裸鼠宫颈癌移植瘤组织中均有TRAIL的表达，转染真核表达hTERTTRAIL组裸鼠宫颈癌移植瘤组织中TRAIL的阳性表达率为50.7%，高于对照组的21.2%，差异有统计学意义(χ2=5.83， P&<0.05，图2) .
　　图2裸鼠宫颈癌移植瘤中TRAIL的表达情况×200（略）
　　3讨论
　　子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一. 由于近年来年轻患者和腺癌比率的增加［3］，宫颈癌的防治面临着新的挑战. 为此，人们致力于探索提高宫颈癌治疗效果的方法. Kuzuya［4］报道以顺铂为基础的联合化疗方案治疗宫颈癌在行手术可提高五年生存率. 同时以顺铂作为放疗增敏剂的研究，认为顺铂可通过使肿瘤细胞在G/S期同步化、抑制放射损伤细胞的修复能力等方式增加了肿瘤细胞的对放疗的敏感性. 同时，辐射可提高细胞膜的通透性，增加对铂类的摄入，从而增加顺铂的毒性作用，提高化疗效果. 放疗化疗药物联合应用治疗复发性宫颈癌取得了一定的疗效和进展［5］.
　　hTERT人端粒酶的限速酶，是肿瘤细胞的特异性启动子，可在转录水平调控目的基因的表达确保对肿瘤细胞的杀伤作用［1］. 宋悦等［6］研究结果显示，在端粒酶阳性的宫颈癌细胞系及永生化的HEK293细胞中，hTERTmRNA表达阳性并且hTERT启动子被激活. 而TRAIL是TNF超家族成员，因其具有的特异性的诱导肿瘤源性和转化细胞，不诱导正常细胞的凋亡［7］，已成为基因治疗的热点.
　　
　　本实验结合了hTERT启动子的肿瘤靶向和TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞的效应，联合放化疗来研究对HeLa裸鼠移植瘤的作用. 实验表明，将hTERT TRAIL稳定转染的肿瘤细胞的裸鼠宫颈癌瘤组织中TRAIL呈阳性表达，在肿瘤细胞的浆膜均有黄褐色沉着，与对照组相比，有统计学意义（P&<0.01）. 实验观察了顺铂联合放疗对裸鼠宫颈癌瘤组织有明显的抑制作用. 转染组肿瘤细胞于接种第5~7日全部长出肿瘤结节，结节出现的时间差异无显著性意义(P&>0.05). 转染hTERTTRAIL组细胞与对照组HeLa细胞在裸鼠体内的瘤质量分别为(0.399±0.087)和( 0.701±0. 057) g， 两者相比差异有统计学意义(P&<0.05) ；基因组、放疗组、化疗组及综合组瘤质量比较，有统计学意义 (F=11.018， P&<0.05). 说明放疗化疗对肿瘤细胞有明显抑制作用，两者具有协同作用;hTERTTRAIL HeLa裸鼠移植瘤肿瘤生长缓慢， 4 wk后肿瘤质量抑瘤率为43.08%，联合放化疗后肿瘤质量抑瘤率为61.63%，两者相比有统计学意义(P&<0.01). 国外Gliniak等［8］实验研究也显示，化疗药物喜树碱能增强TRAIL引起的结肠肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，延长裸鼠的生存期.
　　肿瘤综合治疗是当今肿瘤防治研究的热点， 特别是基因疗法和其他传统疗法联合治疗给肿瘤患者带来了希望［9］. 本实验利用hTERT启动子构建TRAIL表达载体用于基因治疗，并联合放化疗，避免损伤正常细胞，提高治疗的特异性方面有一定的作用，也为肿瘤的进一步实验研究奠定基础，为临床治疗提供思路.
【参考文献】
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　　［2］ Song K， Chen Y， Coke R， et al. Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand ( TRAIL)is an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression［J］. J Exp Med， 2000，191(3):1095-1104.

　　［3］ 曹泽毅. 子宫颈癌治疗的变迁和思考［J］. 中华妇产科杂志，2004，39(3):212-215.
　　
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　　［6］ 宋悦，孔北华，马道新，等. 宫颈癌及子宫内膜癌细胞系中启动子活性的研究［J］. 肿瘤防治杂志，2003，10(3)，442-443.

　　［7］ Kagawa S， He C， Gu J， et al. Antitumor activity and bystander effects of the tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand (TRAIL)gene［J］. Cancer Res， 2001，61（8）:3330-3338.

　　［8］ Gliniak B， Le T. Tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligands antitumor activity invivo is enhanced by the chemotherapeutic agent CPT11［J］. Cancer Res， 1999，59（7）:6153- 6158.

　　［9］Choi CH， Kim TJ， Lee SJ， et al. Salvage chemotherapy with a combination of paclitaxel， ifosfamide， and cisplatin for the patients with recurrent carcinoma of the uterine cervix［J］. Int J Gynecol Cancer， 2006，16(3):1157-1164.