关于酪酪肽对重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织NO生成及iNOS表达的影响

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　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of PYY on NO and iNOS in rats with severe acute pancreatitis (SAP) by detecting NO content and iNOS expression in the pancreatic tissues of rats. METHODS: Being randomly pided into SAP group and treatment group equally in number， 40 rats were injected intraperitoneally with 60 g/L Larginine to induce SAP models. The treatment group was given PYY (0.8 pmol/g) by subcutaneous injection immediately after the first Larginine injection， and 0.8 pmol/g PYY was given 10 times altogether at an interval of 4 h， and the SAP group was given 9 g/L NaCl， the dose and method as Larginine. 48 h after the beginning of modeling， the contents of NO in the homogenates of pancreatic heads were determined with nitrate reductase， and the expressions of iNOS in the pancreatic tails were evaluated after immunohistochemistry staining. RESULTS: iNOS high expression rate and NO content in the pancreatic tissues of the SAP group were 0.90 and (68±3) μmol/g， while they were 0.10 and (22±5) μmol/g respectively in the treatment group. And NO content in pancreas in treatment group was significantly lower than that in SAP group (P＜0.05)， so was the high expression rate of iNOS. CONCLUSION: PYY has a protective effect on acute pancreatitis by inhibiting the NO production and the expression of iNOS in pancreatic tissues.
　　【Keywords】 pancreatitis， acute necrotizing; nitric oxide; nitricoxide synthase; PYY
　　【摘要】 目的： 研究酪酪肽对重症急性胰腺炎（SAP）胰腺组织NO生成及iNOS表达的影响. 方法： 将SD大鼠40只随机均分成SAP组和治疗组，两组均给60 g/L左旋精氨酸腹腔内注射建立SAP模型. 治疗组在第1次注射左旋精氨酸后立即皮下注射酪酪肽(0.8 pmol/g)，此后每次间隔4 h，共10次；SAP组接受同剂量的生理盐水. 开始造模后48 h取胰头组织制成匀浆液，用硝酸还原酶法测定NO含量；取胰尾组织用于免疫组化观察iNOS. 结果： SAP组胰腺iNOS的高表达率为0.90，NO含量为（68±3）μmol/g，治疗组iNOS为0.10，NO为（22±5）μmol/g，两组比较均有显著性差异（P均＜0.05）. 结论： 酪酪肽对SAP有治疗保护作用，这种治疗作用的机制可能与其降低胰腺NO生成及iNOS活性表达有关.
　　【关键词】 胰腺炎，急性坏死性；一氧化氮；一氧化氮合酶；酪酪肽
　　0引言
　　近年来，随着对急性胰腺炎的病理生理学研究的不断深入，除胰酶的自身消化理论外，人们还认识到白细胞过度激活学说、炎性因子的级联瀑布效应学说等多种理论，这些理论的提出对于临床重新认识该疾病并基于该理论建立的治疗体系起着较大的作用，重症急性胰腺炎（SAP）仍是当前困扰临床治疗的一个问题［1］. 深入研究酪酪肽（peptide YY， PYY）对重症急性胰腺炎胰腺组织一氧化氮（NO）及诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达的影响，将有助于进一步揭示PYY治疗SAP的作用及机制，为临床治疗奠定理论基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料健康雄性SD大鼠40只（西安交通大学医学院动物中心），体质量250～300 g，随机均分成重症急性胰腺炎组（20只）和治疗组（20只）. L精氨酸，分析纯级（厦门星龙达化学试剂有限公司）；NO试剂盒（硝酸还原酶法，南京建成生物工程研究所）；iNOS一抗试剂盒和即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；酪酪肽（凤凰制药有限公司）；Leica组织切片机（德国LEICA）；DT100化学天平（北京光学仪器厂）；722分光光度计（北京医疗设备厂）.
　　1.2方法参照文献［2-3］并经本实验改良的腹腔内注射左旋精氨酸法制备大鼠SAP模型，所有大鼠实验前禁食12 h，自由饮水. 两组大鼠均分3次给予腹腔内注射60 g/L 左旋精氨酸(3×1.5 mg/g)，间隔1 h，诱导SAP模型. 治疗组大鼠在第1次腹腔内注射精氨酸后立即皮下注射PYY (0.8 pmol/g)，每次间隔4 h，共10次. 胰腺炎组大鼠皮下注射生理盐水，方法和剂量（即每次每克质量所给的酪酪肽的体积毫升数）同左旋精氨酸. 在开始造模后48 h剖腹，取胰头组织，准确称体质量，按质量体积比为1∶9加生理盐水制备成100 g/L匀浆液，离心，取上清液-20℃保存，用于测定胰腺组织NO含量（硝酸还原酶法）；取胰尾组织用40 g/L甲醛固定，用于胰腺HE染色及免疫组化观察iNOS表达. 均严格按说明书操作检测. 根据Grewal等的方法对胰腺组织损伤进行定量评分. iNOS阳性细胞计数方法：每例切片观察50个高倍视野（×40），对每个视野的阳性细胞计数，求出每例的平均值. 染色强度（阴性、弱、中、强）及阳性细胞率（≤5%，6%～30%，31%～70%，≥71%）分别积分为0，1，2，3分， iNOS免疫组化结果判定采用半定量积分法，即对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞强度分别进行分级计分，两项之和1～3分为低表达，4～6分为高表达.
　　统计学处理： 计量资料数据以x±s表示，组间差异显著性采用双侧t检验法和单因素方差分析法，计数资料的组间差异显著性采用双侧χ2检验法，显著性检验水准取P&<0.05.
　　2结果
　　2.1胰腺病理改变大鼠解剖后大体观，和治疗组相比，胰腺炎组胰腺明显出血坏死，胰周脂肪皂化，伴血性腹水. 胰腺组织HE染色，在电子显微镜下可见 SAP 组胰腺间质和腺小叶炎症细胞浸润，有弥漫性出血及片状坏死，腺泡结构破坏严重，血管明显扩张（图1），治疗组胰腺血管轻中度扩张，腺泡细胞变性和腺小叶结构破坏程度较轻，炎症细胞浸润减少（图2）. 胰腺炎组（10.0±1.6）分，治疗组（4.8±1.5）分，两组比较有显著性差异（P＜0.05）.
　　2.2胰腺组织iNOS表达结果光镜下，iNOS阳性信号为细胞质内出现棕黄色颗粒，胞核染成蓝色. 根据阳性信号着色的强弱将反应强度分为4级：阴性（-）为细胞不着色，染色与背景相似；弱（+）为胞质呈淡棕黄色；强（）为深棕黄色；中（）则介于+和之间. iNOS染色强度、阳性细胞率、半定量评分分别为胰腺炎组（2.60±0.06），（2.10±0.06），（4.70±0.11）分，治疗组为（1.50±0.06），（0.80±0.07），（2.30±0.12）分，两组比较均有显著性差异（P＜0.05）. 胰腺炎组iNOS阳性高表达18例，高表达率为0.90，治疗组iNOS阳性高表达2例，高表达率为0.10，胰腺炎组iNOS表达活性显著增强（图3），高于治疗组（图4），两组比较有显著性差异（P＜0.05）.
　　图1胰腺炎组HE染色×100（略）
　　图2酪酪肽治疗组HE染色×100（略）
　　图3胰腺炎组iNOS免疫组化表达×200（略）
　　图4酪酪肽治疗组iNOS免疫组化表达×200（略）
　　
　　2.3胰腺匀浆液NO含量胰腺炎组NO含量为（68±3）μmol/ g，而治疗组为（22±5）μmol/ g，两组比较有显著性差异（P＜0.05）.
　　3讨论
　　
　　PYY为含36个氨基酸的肽，可抑制基础胰液分泌及迷走神经刺激引起的胰液分泌［4］. Tito等［5-6］报道PYY能抑制胰腺分泌，为CCK释放的抑制剂，接受PYY的急性胰腺炎大鼠胰腺坏死等病理改变明显改善. PYY 可降低TNFa诱导的急性胰腺炎的转录因子活性，对核因子κB （NFκB）及过氧化酶体增生激活受体（PPARα/γ）的活性有抑制作用，对急性胰腺炎有一定的治疗潜力［7-8］. NO及iNOS均为SAP的炎性介质，PYY对SAP的NO及iNOS有何影响作用？我们的结果显示酪酪肽抑制SAP的iNOS活性表达，降低胰腺局部NO含量，改善胰腺的病理损害，酪酪肽对SAP有治疗保护作用. NO是一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质的作用，是炎症反应时介质瀑布样连锁反应的终未共同介质之一，高水平NO主要由激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生，直接可引起细胞的损伤. NO还与超氧阴离子反应生成过氧亚硝基阴离子，具有很强的氧化能力，产生损伤效应［9-10］. 急性胰腺炎时过量的NO是由iNOS催化产生的，在胰腺外分泌系统中，NO主要通过两条途径作用于胰腺：一是通过LArgNOcGMP途径，产生高水平cGMP，进而使促胰腺分泌的体液因素，如胆囊收缩素等增加，导致胰酶分泌增加，而胰液量并不增加，另一方面，由胰管上皮细胞产生的NO可促使胰管上皮细胞分泌胰液增多，故NO在胰腺外分泌过程中起促进作用. 在胰腺组织中，胰岛和腺泡细胞周围，小叶内和小叶间的纤维连接组织，胰管上皮细胞，血管壁等处均有NOS阳性神经纤维分布.

NO通过自分泌或旁分泌形式对胰腺内外分泌，胰腺微循环以及炎症反应过程等的调节，而在胰腺炎的发生发展中发挥作用. iNOS不依赖于钙钙调蛋白，主要分布于淋巴细胞和单核巨噬细胞，正常情况下多不表达，在病理状况下，在内毒素和细胞因子的刺激下使得iNOS转录和翻译而迅速表达，当炎症刺激过强或持续时间过长，由iNOS催化产生过量NO，不仅引起发热，还可导致外周血管扩张和难治性休克，诱发多器官功能障碍. 过量NO释放可致细胞毒性和DNA损伤，对胰腺微血管及胰管内皮造成损伤，引起胰间质水肿，中性粒细胞浸润，胰腺分泌大量胰液，胰液外渗，造成胰腺损伤. 另外胰腺局部的高浓度NO可造成腺泡溶酶体膜的损害，引起胰酶细胞内激活，胰腺组织损伤. 病理情况下，由于细胞因子的刺激，使得iNOS转录和翻译，由iNOS催化产生过量NO，可能产生组织细胞毒性作用. SAP体内iNOS活性上调，胰腺微循环中白细胞黏附的数量及病理形态改变与胰腺组织iNOS的表达和NO的水平正相关，胰腺组织NO及iNOS越高，病理损坏越重［11］. Cuzzocrea等利用基因敲除技术建立iNOS基因缺陷的小鼠模型，证实了iNOS的表达在急性胰腺炎中起到了重要的致炎作用，iNOS可在内毒素和淋巴因子的刺激下迅速表达，产生高浓度的NO，所以有着非常重要的病理作用［12］.
　　
　　本实验中PYY治疗组胰腺损伤病理评分，iNOS的阳性表达率，胰腺组织NO含量与胰腺炎组比较均有显著性差异，治疗组胰腺的病理损害明显减轻，胰腺组织中NO及iNOS的活性表达明显降低. 综上所述，PYY能抑制重症急性胰腺炎iNOS活性表达，降低胰腺局部NO含量，影响胰腺炎的病理过程，对重症急性胰腺炎有治疗保护作用，这种治疗作用的机制可能与其降低胰腺NO生成及iNOS活性表达有关.
基金项目：国家自然科学基金（30170414）

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