关于pIRES2EGFPhBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响

　　　　　　　　　　作者：唐昊喆，王勤涛，董广英，马志伟，丁敖，李长春，孙迎春，王莉

　　【Abstract】 AIM: To construct and identify the eukaryotic expression vector pIRES2EGFPhBMP2 which expressing human hBMP2 and to observe its effects on the phenotype of human gingival fibroblast. METHODS: hMBP2 gene was cloned from human osteogenic sarcoma by RTPCR and inserted into Tvector. After DNA sequencing verification， it was then subcloned into eukaryotic expression vector pIRES2EGFP .After identification by double digestion， the pIRES2EGFPhBMP2 was transfected into HEK293 cells to verify the expression by fluorescence microscope and Western Blot. The construct was transfected into human gingival fibroblast to detect the effects of hBMP2 on the proliferation， ALP activity， content of OC and the ex vivo mineralization capacity of fibroblast by MTT. RESULTS: Human BMP2 gene was cloned successfully and verified by double digestion and DNA sequencing.The constructed eukaryotic expression vector pIRES2EGFPhBMP2 expressed hBMP2 correctly. hBMP2 did not affect the proliferation of human gingival fibroblast but increased the ALP activity， OC content and ex vivo mineralization capacity. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pIRES2EGFPhBMP2 expressing hBMP2 is constructed successfully and this gene promotes human gingival fibroblast to differentiate toward osteoblast.
　　【Keywords】 gingiva; fibroblasts; bone morphogenetic protein2; transfection; osteoblasts
　　【摘要】　目的： 构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响. 方法： 采用RTPCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因，连接T 载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2EGFP连接，酶切鉴定后转染入HEK293细胞中，利用荧光显微镜和Western Blot进行表达鉴定，最后转染人牙龈成纤维细胞，通过ＭＴＴ实验观察转染hBMP2后对人牙龈成纤维细胞增殖特性、ALP活性、OC含量、体外矿化能力的影响. 结果： 成功克隆了人BMP2基因，酶切鉴定及测序均正确，真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2能正确表达hBMP2蛋白，hBMP2对人牙龈成纤维细胞增殖特性无影响，但可增强其ALP活性、OC含量及体外矿化能力. 结论： 构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2，该基因可促进人牙龈成纤维细胞向成骨细胞方向分化.
　　【关键词】 牙龈；成纤维细胞;骨形态发生蛋白质2;转染;成骨细胞
　　0引言
　　人骨形成蛋白2（hBMP2）是骨形成蛋白BMP家族中诱骨活性最强的一种，也是唯一能单独诱导成骨的因子，在牙周组织再生和修复中具有重要的作用. 本研究我们克隆了hBMP2基因，并成功构建了真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2，并观察其对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响，为将其应用于牙周组织工程的种子细胞奠定基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料人成骨肉瘤细胞由第四军医大学唐都医院骨科郑联合博士惠赠. DNaseⅠ， DEPC购自Sigma公司，RNA提取试剂（TRIzol）购自GibcoBRL公司，RTPCR反应试剂盒， Lipofectamine2000， G418购自Promega公司，引物由北京赛百盛公司合成，质粒提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术公司，Taq DNA 聚合酶，DNA marker DL2000，琼脂糖、核酸内切酶EcoRⅠ， XhoI购自大连宝生物工程公司，去离子甲酰胺购自Amersham公司，IPTG， Xgal， pGEMTeasy载体为Promega公司产品，pIRES2EGFP真核表达载体购自Biosciences Clontech公司. JM109菌种由本实验室保存.
　　1.2方法
　　1.2.1hBMP2基因的克隆TRIzol法提取总RNA后反转录为cDNA. hBMP2上游引物：5′CTCGAGGGTCTCCTAAAGGTCGACCATGGTG3′，下游引物：5′GAATTCTCACTTGTCATCATCGTCCTTGTAGTCGCGACACCCACAACCCTCCACAAC 3′，其中下划线分别为XhoI和EcoRI酶切位点，阴影部分为Flag标签序列，所扩增片段的长度为1190 bp. PCR反应条件：94℃， 5 min，94℃， 30 s， 53℃， 60 s， 72℃， 60 s，35个循环，72℃， 5 min. 琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物，与pGEMTeasy连接后转化JM109感受态，铺氨苄抗性的LB平板，挑克隆摇菌. 提质粒后用XhoI， EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定.
　　1.2.2真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2的构建及表达鉴定将质粒pGEMhBMP2和pIRES2EGFP分别用EcoRI和XhoI进行双酶切，胶回收hBMP2片段和线性化的pIRES2EGFP载体，将片段和载体连接后用XhoI， EcoRI双酶切鉴定，所得正确的重组质粒命名为pIRES2EGFPhBMP2. 用Lipofectamine2000将其转染入人胚肾293细胞中，24 h后荧光显微镜恶和Western Blot检测目的蛋白的表达状况.
　　1.2.3人牙龈成纤维细胞的培养及质粒转染用胶原酶消化法从拔牙时切取的健康牙龈组织中分离成纤维细胞，以含100 mol/L FBS的DMEM培养. 实验前用波形丝蛋白和角蛋白抗体染色，鉴定细胞起源. 第5代细胞用于转染. 将pIRES2EGFPhBMP2转入人牙龈成纤维细胞内. 48 h后，换入含350 mg/ L G418的DMEM（100 mL/ L的FBS），筛选2 wk. 转染组细胞命名为TGF，未转染组细胞命名为GF.
　　1.2.4转染细胞的增殖特性取转染后的第5代细胞及未转染细胞，接种于6块96孔板，每孔2×103个细胞，每组接种6孔. 每天同一时间点取出一块培养板进行MTT实验，绘制细胞生长曲线，计算倍增时间.
　　1.2.5碱性磷酸酶（ALP）活性检测及骨钙素(OC)含量检测取转染后第5代及未转染细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板，每组接种12孔. 5 d后一半细胞按试剂盒说明测定各组细胞的碱性磷酸酶活性，另一半取待测各组细胞上清液 100 μL ，125I标记的OC抗体100 μL和未标记的OC抗体100 μL混合后4℃放置24 h. 每管加入分离剂0.5 mL，混匀后室温放置20 min，4℃ 3500 r/min离心20 min，弃上清，检测沉淀物的放射剂量.
　　1.2.6矿化结节形成实验取转染后第5代和未转染细胞，以5×104/孔的密度接种于放有盖玻片6孔板，每组接种3孔（每孔玻片3张）. 24 h后加入矿化液（10 mmol/ L β甘油磷酸钠， 50 mg/ L βV itC和10-8 mol/ L地塞米松），每3 d换液1次，连续培养21 d. 取出盖玻片，以4 g/L中性甲醛固定，采用vonKossa染色法进行染色，观察矿化结节形成情况.
　　2结果
　　2.1RTPCR扩增人BMP2基因提取总RNA经反转录后PCR扩增出人BMP2基因的蛋白质编码序列，PCR产物大小与预期的1190 bp相符，GAPDH的大小与预期的307 bp相符，说明反转录产物的质量很高（图1）.
　　M: DNA marker DL2000；1: hBMP2.
　　图1RTPCR结果（略）
　　2.2pIRES2EGFPhBMP2的构建及鉴定 以EcoRI和XhoI分别酶切pGEMhBMP2和pIRES2EGFP，将目的片段插入到质粒pIRES2EGFP的XhoI和EcoRI多克隆位点上，获得融合表达载体pIRES2EGFPhBMP2，转化大肠杆菌JM109，扩增后提取质粒，酶切鉴定结果显示重组载体构建成功（图2）.
　　M: DNA marker DL2000；1: pIRES2EGFPhBMP2/EcoRI+XhoI 酶切产物.
　　图2重组表达质粒pIRES2EGFPhBMP2的双酶切鉴定（略）
　　2.3pIRES2EGFPhBMP2的表达鉴定将pIRES2EGFPhBMP2用脂质体转染入293细胞后24 h，荧光显微镜观察发现90％以上的细胞均呈现绿色(图3A). Western Blot结果发现在Mr46 000处有一特异性条带，表明构建的载体能够正确表达蛋白（图3B）.
　　2.4细胞的增殖特性转染和未转染细胞的生长曲线基木重合，说明基因转染对人牙龈成纤维细胞增殖无影响. 倍增时间分别为44和43 h（图4）.
　　2.5ALP活性和OC含量的测定结果转染组与未转染组牙龈成纤维细胞的ALP活性分别为0.55±0.07和0.21±0.05，OC含量分别为(1.15±0.04)和(0.23±0.03) ng/L，均有显著差别（P&<0.01）.

　　图3荧光显微镜(A)和Western Blot鉴定pIRES2EGFPhBMP2的表达(B)（略）
　　图4牙龈成纤维细胞转染组与未转染组的生长曲线（略）
　　2.6矿化结节形成实验转染细胞在矿化液作用下，随时间延长细胞密度逐渐增大，呈复层生长，并在局部聚集. 第21日时，倒置显微镜下可见致密的结节形成（图5A），vonKossa染色可见紫色的矿化结节形成（图5B），未转染细胞则未见结节形成.
　　图5牙龈成纤维细胞在矿化液作用下形成矿化结节（略）
　　3讨论
　　
　　组织工程技术引入牙周病治疗的研究领域，为实现牙周组织完全功能性再生的实现带来了新的希望［1］. 最近文献认为，牙龈成纤维细胞作为牙周组织的组成成分，具有与牙周膜细胞相似特点，己从中分离出成骨细胞表型；在适当的刺激（如BMP2)作用下，可表达较高ALP活性、合成OC并形成体外矿化结节，还能表达骨相关大分子物质以及与BMP信号转导相关的基因产物. 因此，牙龈成纤维细胞可能也具有一定的成骨能力，是BMP的靶细胞. 这为牙龈成纤维细胞作为牙周组织工程的种子细胞的研究提供了实验依据［2］.
　　骨形态发生蛋白(BMP ) 在胚胎发育、神经、造血等组织的形成和分化中具有重要作用［3］，尤其是它能在非骨组织中诱导新骨形成，其中BMP2被认为是活性最强的诱导成骨因子［4］. 鉴于目前得到足够、有活性的BMP2蛋白仍有难度，并且全身应用BMP蛋白可能对身体其他器官产生副作用或诱发免疫反应. 解决的方法可以选择局部基因治疗，因此，如何选择一个易于检测且不影响目的基因表达的载体就显得尤为重要.
　　
　　质粒pIRESEGFP为双顺反子真核表达载体，在其多克隆位点和EGFP编码区基因之间设计有核糖体进入位点(IRES)，此位点引导真核细胞mRNA 40S亚基的募集，用于转录后修饰的SV40 mRNA早期Poly A信号肽与EGFP相隔约150个碱基，确保克隆入多克隆位点的外源基因与EGFP编码基因共同转录；而翻译出来的EGFP与目的蛋白各具独立的空间结构和生理活性，而不是融合蛋白. 所以，IRES作为一种生物技术工具，在基因治疗中的直接作用就是从一条多顺反子mRNA翻译几个目的蛋白［5］，并允许两个目的基因同时并且同水平表达［6］.
　　
　　本研究我们用RTPCR方法从人成骨肉瘤细胞系中克隆了hBMP2基因，测序表明序列完全正确，并成功构建了该基因的真核表达载体pIRES2EGFPhBMP2. 将表达载体转染293细胞后，利用荧光显微镜和Western blot证实该基因在细胞中能够正确表达. 转染牙龈成纤维细胞后表明该基因对成纤维细胞的增殖特性，如生长曲线、倍增时间等指标与对照组无明显差异.
　　
　　评价一种细胞是否具有成骨细胞倾向需多种指标的结合，包括细胞的ALP活性、OC含量、体外矿化能力等. 本实验结果显示，hBMP2基因转染牙龈成纤维细胞后ALP活性、OC含量、体外矿化能力等成骨细胞表型的指标明显高于对照组，表明基因转染促进牙龈细胞向成骨细胞方向分化，为将其应用于牙周组织工程的种子细胞奠定了实验基础.
【参考文献】
　　［1］ 王敏，翁雨来，冯希平. 牙周病致牙槽骨缺损的治疗进展［J］. 上海口腔医学，2002，11(3):261-264.

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　　［3］ Wozney JM. Overview of bone morphogenetic proteins［J］. Spine， 2002，27(16 Suppl 1):S2-S8.

　　［4］Zhou W， Edelman GM. Transcript leader regions of two Saccharomyces cerervisiae mRNAs comain interna1. Ribosome emry sites that function in living cells ［J］. Proc Natl Acad Sci UsA， 2001，98:1531-1536.

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