关于低氧条件培养的PASMCs凋亡与p53表达变化

　　　　　　　　 作者：彭利静 李伟 段永宏 李志超

　　【Abstract】 AIM: To observe apoptosis and p53 expression changes in hypoxia cultured rat pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs). METHODS: The PASMCs were cultured primarily by tissueculture method. The number of apoptotic cells was measured by Hoechst staining and flow cytometry. P53 expression in PASMCs was demonstrated by immunofluorescence(IF) staining and observed by confocal microscopy. RESULTS: Hoechst staining and flow cytometry showed that the number of apoptotic cells was not significantly different between control group and hypoxic 24 h group. IF staining showed that the expression intensity of p53 was increased significantly in hypoxic 24 h group than in control group. CONCLUSION: In the cultured PASMCs， hypoxia does not enhance cell apoptosis， but increases p53 expression.
　　【Keywords】 anoxia; pulmonary artery; muscle， smooth/cytology; genes， p53; apoptosis
　　【摘要】 目的： 观察低氧条件下离体培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的凋亡和p53表达的变化. 方法： 采用组织块法原代培养大鼠PASMCs，应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响；采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察p53在低氧条件培养的PASMCs中的表达变化. 结果： 正常条件下培养的PASMCs 和低氧条件下培养的PASMCs的凋亡变化不大，荧光显微镜下凋亡细胞计数后亦未见有统计学差异. p53在培养的大鼠PASMCs中有少量表达，低氧刺激可使其表达增高（P&<0.05）. 结论： 低氧未能诱导离体培养的PASMCs凋亡增加，但可以诱导p53在培养的大鼠PASMCs中的表达增加.
　　【关键词】 缺氧；肺动脉；肌，平滑/细胞学；基因，p53；细胞凋亡
　　0引言
　　
　　肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension， PAH）是临床上常见的呼吸系统疾病，肺血管收缩和肺小血管结构重建是其发病的基本病理过程；目前研究认为，肺血管壁细胞增殖和凋亡的失衡是肺血管壁结构重建的重要原因［1-2］. p53是近年研究最为广泛和深入的肿瘤抑制基因之一，由于在慢性肺动脉高压的形成过程中，也有类似肿瘤细胞的过度增殖以及细胞凋亡的变化. 因此，研究p53在肺动脉高压发生中的作用，对于了解肺动脉高压的发病机制，指导临床治疗有一定的积极作用. 本研究我们采用组织块法原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells， PASMCs），应用Hoechst染色以及流式细胞术观察低氧对细胞凋亡的影响，同时采用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察p53表达的变化，了解p53在肺小血管结构重建中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料雌雄不拘SD大鼠，体质量150～180 g（第四军医大学实验动物中心）；RPMI1640培养液（GIBCO公司）；新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）；p53多克隆兔抗鼠IgG， FITC标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒（Beyotime生物公司）；三气培养箱（德国Heraeus公司）；激光扫描共聚焦显微镜MRC1024（美国BIORAD公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠PASMCs的分离及培养采用组织块法原代培养. 健康大鼠用200 g/L乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉后打开胸腔，无菌操作分离肺动脉，剥离血管外膜组织，纵向剪开血管，刀片轻刮内膜，置于盛有2 mL新鲜RPMI1640培养液（含有150 mL/L小牛血清）的青霉素小瓶中，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，均匀贴于25 mL培养瓶底部，补加3 mL培养液，盖好瓶盖并拧松半圈，将培养瓶底部向上放入CO2孵箱. 37℃， 50 mL/L CO2， 950 mL/L O2条件下孵育4 h后，反转培养瓶. 3～5 d后，即可在镜下观察到有细胞晕出现. 观察细胞生长状况，2～3 d换一次培养液，10~13 d后可用2.5 g/L胰酶消化传代. 实验选用培养至第3～5代的细胞进行.
　　1.2.2实验分组分为正常对照组和低氧24 h组. 正常对照组置于37℃， 50 mL/L CO2， 95 mL/L O2孵箱内培养，低氧组置于37℃， 20 mL/L O2， 50 mL/L CO2， 930 mL/L N2孵箱内培养.
　　1.2.3培养大鼠PASMCs Hoechst染色将实验细胞制备成单细胞悬液，以5×104/L密度、每孔2 mL分别接种入2个24孔板内，37℃，50 mL/L CO2， 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后换无血清培养液，分组培养24 h后吸尽培养液，按试剂盒说明书进行操作，染色5 min后在荧光显微镜下（×200）观察. 随机采集5个不重复视野，计数每100个细胞中凋亡细胞数目.
　　1.2.4培养的PASMCs流式细胞术检测将细胞消化后以5×104/L密度种入100 mL培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2 ， 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后各组均换成无血清培养液，分组继续培养24 h后终止，制成单细胞悬液，进行AnnexinVflous标记染色，测定细胞凋亡.
　　1.2.5培养的PASMCs的p53免疫荧光染色及观察取制备好的单细胞悬液，以5×104/L密度、每孔2 mL分别种入2个24孔板内爬片，37℃， 50 ml/L CO2 950 mL/L O2孵箱培养. 24 h后换无血清培养液. 分组继续培养24 h后，常规固定、冲洗、封闭，滴加1∶100稀释的兔抗鼠p53 IgG，4℃湿盒过夜，次日滴加FITC标记山羊抗兔IgG，37℃，2 h后冲洗封片. 激光扫描共聚焦显微镜观察，激发光波长488 nm，放大倍数400×1.23（40倍油镜）. Lasersharp图像分析软件，分析单个细胞核平均荧光强度.
　　
　　统计学处理：所有实验数据均采用SPSS10.0统计学软件进行t检验分析处理，结果用x±s表示.

　　2结果

　　2.1低氧对细胞凋亡的影响正常组织细胞经Hoechst染色后，荧光显微镜下可观察到蓝色的细胞核. 凋亡细胞由于核固缩、核碎裂、溶解，染色后可观察到细胞核致密浓染，或呈碎块状. 本实验显示正常条件下培养的PASMCs凋亡数与低氧24 h组的PASMCs的凋亡数没有明显差异［(16±4) vs (17±3)， n=5， P&>0.05］. 流式细胞术是应用双染色法标记检测细胞凋亡较敏感的方法. 结果同样显示： 正常对照组凋亡细胞数为4.5％，低氧24 h组凋亡细胞数为5.6％. 以上结果均提示低氧条件未能诱导离体培养的PASMCs凋亡增加.
　　2.2低氧对大鼠PASMCs中p53表达的影响免疫荧光染色后，可见正常对照组细胞核荧光较淡，部分细胞甚至未见有荧光发出. 低氧24 h组几乎所有胞核都有较强荧光发出，荧光强度与正常对照组相比明显增强［(48.1±4.7) vs (15.7±2.2)， n=5， P&<0.05］，表明p53表达明显增加 (图1).
　　A： p53在常氧培养的PASMCs中的表达；B： p53在低氧24 h培养的PASMCs中的表达
　　图1培养的PASMCs的p53免疫荧光染色400×1.23（略）
　　3讨论
　　
　　PAH常引起严重的呼吸血流功能紊乱，治疗困难，一直是临床研究的重点. 其中，低氧所引起的慢性PAH的形态学特征主要表现为肺小动脉中层平滑肌细胞增生、增大. 细胞凋亡是调节细胞数量的重要方式. 故观察PASMCs的增殖和凋亡对探讨慢性PAH的发病机制、指导临床治疗研究更有意义. 文献［3］报道：在慢性PAH大鼠的肺小动脉壁细胞增殖的过程中，细胞凋亡显著增加，且凋亡细胞数随低氧时间延长而增加. 其生理意义在于试图从整体上维持平滑肌细胞数目的动态平衡. 本研究提示在用低氧刺激离体培养的PASMCs时，细胞凋亡无显著变化，说明离体状态下，低氧并不是诱导PASMCs的凋亡增加的直接因素. 因此推论，慢性PAH大鼠的肺小动脉壁细胞凋亡的明显增加是神经、体液等因素共同作用的结果，而非低氧的直接结果.
　　
　　p53是抑癌基因，也是凋亡相关基因，其表达增多和磷酸化可以诱导细胞中的DNA损毁，从而诱导细胞凋亡［4］. p53还能通过细胞凋亡相关分子的表达，增强细胞对凋亡刺激的敏感性. 相关实验证明，低氧能增加神经细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等的凋亡以及凋亡相关因子p53， bax表达的显著变化［5］. PAH的发生发展及其严重程度与PASMCs的凋亡密切相关，诱导凋亡可以减轻肺动脉高压的发病程度［6］.
　　
　　本实验结果表明低氧不能直接诱导的离体培养的PASMCs的凋亡增加，但可以诱导p53的表达显著增加，提示p53有可能参与了低氧诱导的慢性PAH大鼠的肺小血管壁平滑肌细胞凋亡的调控，从而参与了肺小血管壁结构的重建.

参考文献

　　［1］ Mandegar M， Cheng YB， Huang W， et al. Cellular and molecular mechanisms of pulmonary vascular: Role in the development of pulmonary hypertension［J］. Microvasc Res， 2004，(68)：75-103.

　　［2］ Humbert M， Morrell NW， Archer SL， et al. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension［J］. J Am Coll Cardiol， 2004，43(12)：13S-24S.

　　［3］ 彭利静，李志超，李伟. 慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺组织p53表达增高［J］. 基础医学与临床，2006，26（9）: 984-987.

　　［4］ 张振锋. P53与人类肺癌研究进展［J］. 国外医学内科学分册，1999，26（6）:255-261.

　　［5］ Chattergoon NN， D’Souza FM， Deng W， et al. Antiproliferative effects of calcitonin generelated peptide in aortic and pulmonary artery smooth muscle cells［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2005， 288(1): 202-211.

　　［6］ Zhang S， Fantozzi I， Tigno DD. Bone morphogenetic proteins induce apoptosis in human pulmonary vascular smooth muscle cells［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2003， (285):L740–L754.