关于shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响

　　　　　　　　 作者：杨义明　刘预　涂植光　陈亚芹　刘靳波

【摘要】 目的： 应用RNA干扰技术抑制COX2基因，观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响. 方法： 构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNACOX2，转染肝癌细胞HepG2，用RTPCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX2的抑制效应，MTT法检测对HepG2细胞生长的影响. 结果： 与未转染组相比，pshRNACOX2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX2 mRNA及蛋白表达，抑制率分别为69.9％和50.3％；并可抑制HepG2细胞生长，72 h后有统计学差异(P&<0.05). 结论： pshRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖.
【关键词】 RNA干扰；重组表达载体；环氧化酶2；肝肿瘤
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of inhibition of cyclooxygenase2（COX2） with RNA interference (RNAi) on the growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells. METHODS: The eukaryotic expression plasmid of short hairpin RNA (shRNA) targeting COX2 gene (pshRNACOX2) was constructed and transfected into hepatocellular carcinoma HepG2 cells; the expressions of COX2 mRNA and protein were detected with reverse transcriptional polymerase chain reaction (RTPCR)and Western Blot assay， respectively. The growth of HepG2 cells was detected by MTT. RESULTS: Compared with untransfected group， recombinant expression vector pshRNACOX2 resulted in the reduction of COX2 mRNA and protein by 69.9% and 50.3% respectively， and the growth of HepG2 cells was significantly inhibited after 72 h (P&<0.05) . CONCLUSION: Recombinant expression vector pshRNACOX2 can significantly inhibit the expression of COX2 gene ， and suppress the growth of tumor cells.
　　【Keywords】 RNA interference; recombinant expression vcectors; cyclooxygenase2; liver neoplasms
　　0引言
　　环氧化酶（cyclooxygenase， COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，包括COX1和COX2两种同工异构体. 近年来研究表明，许多肿瘤，如结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌等COX2呈高表达状态，并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用［1-6］. 研究表明选择性COX2抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，而成为肿瘤基因治疗的靶点. 我们采用RNA干扰(RNAi)技术抑制COX2基因表达，观察对肝癌细胞生长的影响，为利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗途径提供实验依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　真核表达质粒pGenesil1购于武汉晶赛公司，含有人鼠人共用U6启动子和编码绿色荧光蛋白的报告基因. COX2靶基因序列：AACATGGAATTACCCAGTTTG .shRNA转录DNA模板：正向链为5′GATCCC ATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGT CGAA3′，反向链为5′AGCTTGTCGACAAAAACATGGAA TTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGT AATTCCATG G3′， 以上片段由上海生工公司合成. 经Blast与现有人类基因无同源性的序列：5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′作为阴性对照，称为HK（武汉晶赛合成）. 肝癌细胞株HepG2，大肠杆菌JM109由本实验室保存. RPMI1640（Hyclone），新生小牛血清（杭州四季青公司产品），阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000(Invitrogen)，HindⅢ， BamHⅠ， RTPCR试剂（大连宝生物公司产品），COX2一抗（Santa Cruz产品），COX2二抗， DAB显色试剂（北京中杉公司产品）. 肝癌细胞株HepG2用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，50 mL/L CO2培养箱常规培养，待细胞铺满瓶底80％左右时传代.
　　1.2方法
　　将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释，等摩尔混合. 94℃ 5min，缓慢降至室温形成互补双链. HindⅢ，BamHⅠ双酶切质粒pGenesil1，凝胶回收大片段线性DNA，T4连接酶4℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109， 铺含卡那霉素的LB抗性板培养16 h，挑取菌落，增菌， 提取质粒， 酶切鉴定并测序确认. 实验分为3组：未转染细胞HepG2组，pshRNACOX2组，阴性对照HK组. 用2.5 g/L的胰酶常规消化对数期生长的细胞，稀释成1×108 /L， 每孔2 mL，接种于六孔培养板，待细胞铺满80％左右时转染. 首先用无血清无双抗RPMI 1640培养基洗涤2遍. 质粒4 μg，加无血清无双抗RPMI 1640培养基250 μL，脂质体10 μL，加无血清无双抗RPMI 1640培养基250 μL，静置5 min，将二者轻轻混匀，静置20 min，加六孔入培养板常规培养， 4～6 h换生长培养液，24 h转种培养瓶. G418筛选： 初始终浓度800 mg/L， 4 d左右大部分未转染细胞将被处死，维持终浓度400 mg/L，2～3 wk收集细胞，供RTPCR 和Western Blot分析.
　　1.2.1肿瘤细胞中COX2 mRNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞，冷PBS洗涤2遍，按试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录成cDNA . PCR：COX2引物序列：P1：5′TTCAAATGAGAT TGT GGG AAA AT3′， P2: 5′AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT3′，扩增片段长度304 bp. 内参βactin引物序列：P1：5′GGG ACC TGA CTG ACT ACC TC3′ P2： 5′CGT CAT ACT CCT GCT TCC TG3′，扩增片段长度543 bp. PCR循环：94℃ 40 s， 55℃ 30 s， 72℃ 50 s， 38个循环. Western Blot主要步骤：用RIPA（含PMSF蛋白酶抑制剂）细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性上样，行100 g/L十二烷基硫酸钠－聚丙烯胺凝胶电泳，转NC膜，用50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加COX2多抗（1∶200），4℃过夜，TBST洗涤3次（10 min/次），二抗（1∶5000）室温2 h，洗涤3次，每次10 min，DAB显色. 数码照相.
　　1.2.2MTT实验检测细胞生长情况用2.5 g/L胰酶将对数期生长细胞消化下来，稀释成1×108 个/L，转种96孔板，每孔200 μL，置于37℃， 50 mL/L CO2培养箱培养，分别于24， 48， 72， 96， 168 h时，每孔加终浓度为5 g/L MTT 200 μL，继续培养3 h，终止反应. 弃去上清液，加DMSO 200 μL/孔，充分振荡10 min，酶标仪（波长570 nm）测定吸光度A值. 每组3个复孔，取其平均吸光度A值，比较个组细胞生长情况.
　　统计学分析：RTPCR 和Western Blot结果用Quantity one 软件分析灰度值，计算抑制率. MTT结果采用均数±标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1psRNACOX2重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落，增菌并提取质粒，HindⅢ， BamHⅠ双酶切切出400 bp左右的DNA片断，经测序插入片断序列正确（图1）. pshRNACOX2重组质粒转染48 h时，转染率为50%左右（图2）.
　　2.2 shRNACOX2 重组质粒对COX2表达的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2重组质粒对βactin无抑制作用，而对靶基因COX2 mRNA有明显的抑制作用，抑制率为69.9％，未转染细胞与阴性对照之间没有差异（图3A）. 与未转染细胞与未转染细胞相比，βactin及阴性对照HK几乎无变化，而转染pshRNACOX2质粒的细胞COX2蛋白表达水平明显下降，抑制率为50.3％（图3 B）.
　　2.3pshRNACOX2重组质粒转染对细胞增值的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2重组质粒转染后，24， 48 h时吸光度A值变化不明显，而72 h后吸光度A值明显下降. 说明72 h后细胞增殖开始得到抑制. 转染阴性对照质粒HK的细胞与未进行转染的HepG2细胞相比，转染后24， 48， 72， 96， 168 h细胞生长和增殖均未受到影响（图4）.

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　　RNA干扰（RNA interference， RNAi）是通过双链RNA介导同源性mRNA的特异性降解，导致转录后基因沉默，作为一种高效、特异的基因调节技术，目前已经成为研究基因功能的有力工具. RNAi现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了新的方法. 利用RNAi技术抑制 hTERT， Survivin的表达，可以起到抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，达到治疗肿瘤的目的［7-8］，显示出RNAi技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜力. 小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）可在哺乳细胞中诱导特异性基因沉默. siRNA可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径合成，但化学合成成本昂贵，内切酶可导致非特异性效应，且有siRNA瞬时转染介导的沉默效应持续时间短的缺点. 如果将转录siRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游，可在细胞内持续转录产生小RNA分子，通过自身折叠形成发夹样（hairpin）结构，即内源性 siRNA，可与靶基因结合降解 mRNA，实现靶基因的持续抑制 ，可克服上述缺点. 我们将靶向抑制COX2基因的siRNA的DNA转录模板插入到质粒pGenesil2 的U6启动子下游，转录的mRNA通过自身折叠形成发夹样结构（shRNA），经Dicer酶切割形成siRNA，供探讨其对靶基因COX2抑制效应. 我们构建的靶向抑制COX2基因的重组表达质粒转染肝癌细胞HepG2后COX2基因及蛋白显著下调，抑制率分别为69.9％和50.3％，而对内参基因βactin没有影响，提示利用RNAi技术抑制COX2基因表达是切实可行的. MTT实验显示，pshRNACOX2重组质粒转染HepG2细胞72 h后，细胞增殖明显减慢，与未转染细胞组相比有显著性差异（P&<0.05），并可持续至少1 wk. 本研究表明，利用RNAi技术可抑制COX2表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，为高表达COX2基因的恶性肿瘤基因治疗新途径提供了实验依据.

基金项目：重庆市自然科学基金项目（2006BB5271）

参考文献

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