关于HMG CoA还原酶抑制剂对肾病综合征大鼠肝脏高密度脂蛋白受体表达的影响

【摘要】 目的： 在大鼠肾病模型中观察使用3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂洛伐他汀治疗对肝脏高密度脂蛋白（HDL）受体表达的影响，探讨他汀类药治疗肾病综合征高脂血症的机制. 方法： 给予大鼠2次尾静脉注射阿霉素建立肾病综合征大鼠模型；采用灌胃法给予大鼠洛伐他汀治疗2 wk;采用Western Blot和RTPCR技术分别检测HDL受体蛋白和其mRNA在肝脏的表达，同时检测大鼠相关血生化指标. 结果： 给予肾病综合征大鼠洛伐他汀治疗2 wk后，血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和三酰甘油以及尿蛋白均显著降低，血清白蛋白显著升高（P&<0.05）；血肌酐与对照组比较差异无统计学意义(P&>0.05)；肝脏HDL受体蛋白与肾病综合征组比较显著增加(治疗组和肾病综合征组吸光度分别为334.35±13.20和121.93±7.99， P&<0.01)；肝脏HDL受体mRNA与肾病综合征组比较无统计学意义(治疗组和肾病综合征组mRNA相对系数分别为0.54±0.03和0.50±0.02，P&>0.05). 结论： 肾病综合征大鼠经洛伐他汀治疗后，肝脏HDL受体的缺乏得到明显改善，同时大鼠高胆固醇血症降低.
【关键词】 肾病综合征； 大鼠； 洛伐他汀； 受体，HDL
　　【Abstract】AIM: To observe the effects of HMGCoA (3hydroxy3methylglutaryCoA) reductase inhibitor on hepatic expression of high density lipoprotein (HDL) receptor in nephrotic rats. METHODS: Adriamycininduced nephrotic rat models were established by twice injection of adriamycin via the tail vein. Nephrotic rats were treated with either lovastatin(20 mg/kg·d) or placebo for 2 weeks. The expressions of hepatic HDL receptor gene and protein were detected with Western Blot and RTPCR， respectirely. Related serum biochemical parameters were examined. RESULTS: After 2 weeks of lovastatin administration， serum levels of total cholesterol， HDL cholesterol， triglyceride and urinary protein excretion were significantly decreased， serum albumin was significantly increased in study group（P&<0.05）; no significant change was found in serum creatinine （P&>0.05）. Hepatic HDL receptor protein deficiency was significantly ameliorated in study group（optical density values in L group treated with lovastatin and N group treated with placebo were， respectively， 334.35±13.20 and 121.93±7.99， P&<0.01）. There was no significant difference in hepatic HDL receptor mRNA expression in study group（mRNA relative expression in L group and N group were， respectively， 0.54±0.03 and 0.50±0.02， P&>0.05）. CONCLUSION: HMGCoA reductase inhibitor lovastatin might improve hepatic HDL receptor deficiency and ameliorate the associated hyperlipidemia in the nephrotic rats.
　　【Keywords】 nephrotic syndrome; rats; lovastatin; receptors， HDL
　　0引言
　　在实验性肾病综合征大鼠模型中，血清高胆固醇血症通常伴随富含载脂蛋白AI的高密度脂蛋白（HDL）浓度的显著升高［1］. 3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMG CoA)还原酶抑制剂，或他汀类药物对肾病综合征高脂血症能提供有效的治疗，其机制到目前仍不十分明确. 我们在阿霉素导致的肾病综合征大鼠模型中给予洛伐他汀治疗来观察其对肝脏HDL受体表达的影响，探讨其治疗肾病综合征高脂血症的机制.
　　1材料和方法
　　1．1材料
　　SpragueDawley（SD）大鼠，雄性，体质量250~300 g，中山大学实验动物中心提供；阿霉素，意大利爱宝大药厂产品；洛伐他汀，浙江海正药业股份有限公司产品；Western Blot法中一抗为多克隆小鼠抗大鼠SRBI抗体，CHEMICON公司产品，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1000)抗体；βactin引物为CLONTECH公司产品；PCR仪采用美国MJ公司多功能PCR仪.
　　1．2方法
　　1．2．1动物模型制作及给药方法SD大鼠，自由饮水和进食，观察1 wk后随机分成3组：正常对照组（C）10只、肾病综合征组（N）10只、洛伐他汀组（L）10只. N组和L组肾病综合征模型参照文献［2］制作 ，分别在第1日和第14日2次尾静脉注射阿霉素，剂量为每次3.5 mg/kg. C组尾静脉注射等量生理盐水，共2次，时间与前两组相同. 第2次阿霉素注射后观察2 wk，实验第4周末测每组大鼠24 h尿蛋白定量，结果正常对照组（C组）为4.08±3.51 mg/d，肾病综合征模型组（包括N组和L组）为183.27±50.04 mg/d，即出现大量蛋白尿，说明肾病综合征大鼠模型成功. 自实验第5周开始，L组接受洛伐他汀治疗，剂量为每日20 mg/kg，溶解在生理盐水中灌胃治疗，1次/d；N组和C组接受等量生理盐水灌胃，1次/d，各组治疗时间均为2 wk. 各组大鼠经2 wk（实验第6周末）治疗后收集24 h尿液，然后在麻醉下（戊巴比妥钠50 mg/kg体质量，腹腔注射）打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清于-20℃保存备用；并立即取出肝组织放入液氮中，然后转移到-80℃冰箱保存备用.
　　1．2.2检测方法和指标
　　1．2.2．124 h尿蛋白测定采用考马斯亮兰G250法.
　　1．2.2．2血液各项生化指标检测采用日立7060型全自动生化分析仪.
　　1．2.2．3肝组织HDL受体蛋白的测定采用Western Blot法， 取一定量的肝组织，估计其体积，加入2倍体积预冷的细胞裂解液，冰上匀浆，超声波作用30 s，沸水浴5 min，立即置于冰上2 min，4 ℃ 12 000 g离心5 min，吸取上清，测定蛋白浓度，各组分别取总蛋白30 μg，经105 mg/L SDSPAGE电泳后转膜，与特异性一抗37 ℃温育2 h ，4 ℃过夜，用含有500 mg/L Tween20的PBS洗涤膜3次，每次10 min，再与二抗室温孵育1 h 后， 用含有500 mg/L Tween20的PBS洗涤膜3次，每次10 min，1×TBS溶液洗涤5 min，LumiGLO室温孵育1 min，暗房中冲洗胶片. 将胶片图象扫描存入电脑，应用软件读取条带吸光度.
　　1．2.2.4HDL受体mRNA测定采用RTPCR技术，βactin作为内参照. 取肝组织约100 mg加入1 mL Trizol试剂，匀浆，氯仿抽提法提取总RNA，加入无RNase的DNase，37 ℃孵育10 min 后，加入DNase抑制剂. 用获得的RNA 进行逆转录：取总RNA 1 μg，加入随机引物六聚体，70 ℃预变性5 min，再加入逆转录酶试剂，37 ℃ 60 min，95℃ 5 min后终止反应，此时mRNA已经逆转录为cDNA. 取2 μL cDNA 产物为模板行PCR扩增，HDL受体上游引物：5′ CCCTGTTCCCTTCTACTTG3′;下游引物：5′GGCTTGTGGGCTTGTCC 3′. βactin引物为CLONTECH公司产品. 加入Taq DNA聚合酶，95℃预变性3 min进入循环：95℃变性60 s，55℃退火60 s ，72℃延伸90 s，循环扩增35 次，扩增长度为287 bp. 取扩增后产物10 μL， 1.5×104 mg/L琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外光下观察结果. 将凝胶电泳图像输人Kodak凝胶分析系统，计算HDL受体与βactin扩增条带吸光度比值(相对系数)作为其表达强度.

转贴于 　　统计学方法： 实验数据以x±s表示，组间比较采用方差分析，多重比较利用LSDt检验. P&<0.05示差别有统计学意义.
　　2结果
　　2．1血生化和尿蛋白检测血生化和尿蛋白数据见表1， N组表现为大量蛋白尿、低白蛋白血症、血清总胆固醇、HDL胆固醇及三酰甘油浓度均明显升高，与C组比较，差异均有统计学意义. 与N组比较， L组血清总胆固醇、HDL胆固醇及三酰甘油浓度显著降低，低白蛋白血症显著改善，同时尿蛋白显著减少，差异均有统计学意义（P均&<0.05）. 血肌酐在各组间差异无统计学意义(P&>0.05). 表1实验各组血生化和尿蛋白检测结果(略）
　　2．2肝脏HDL受体蛋白及mRNA表达肝组织HDL受体表达检测结果见图1和图2，肝组织HDL受体蛋白表达在N组显著降低，与C组比较差异有统计学意义(N组和C组吸光度分别为121.93±7.99和390.2±23.70， P&<0.01)；而在L组肝组织HDL受体蛋白的缺乏得到显著改善，与N组比较差异有统计学意义（L组和N组吸光度分别为334.35±13.20和121.93±7.99， P&<0.01）. 肝组织HDL受体mRNA在各组间比较差异均无统计学意义(N组、C组和L组mRNA相对系数分别为0.50±0.02， 0.56±0.04和0.54±0.03， P均&>0.05).
　　3讨论
　　1996年Acton等［3］分离并克隆出一个细胞膜蛋白，其表现出高度的HDL亲合特性，这个蛋白被发现高度表达在肝脏以及肾上腺、睾丸和卵巢，它为B类I型清道夫受体（SRBI），并被认为是长期寻找的HDL受体. 许多研究表明肝脏内SRBI的表达对体内HDL的代谢和保持总的体内胆固醇的稳态起着重要作用［4］. 肝脏过度表达SRBI可导致血清HDL胆固醇水平降低、HDL胆固醇脂清除增加以及胆汁内胆固醇增加，胆固醇从肝脏到胆汁的运输也增加. SRBI敲除鼠以及肝脏SRBI表达减弱鼠表现为增加的血清HDL胆固醇浓度，选择性的HDL胆固醇清除下降，胆汁中胆固醇的浓度下降，排泄减少.
　　有关SRBI在肾病综合征中表达的改变则报道极少，本研究结果显示在肾病综合征大鼠血清总胆固醇、HDL胆固醇浓度显著升高的同时肝脏HDL受体蛋白表达严重下降，和Liang等［5］的报道一致. 而给予HMGCoA还原酶抑制剂洛伐他汀治疗后肝脏SRBI蛋白明显升高，其机制可能是因为洛伐他汀治疗后抑制了肝细胞内胆固醇的生物合成从而导致肝细胞内胆固醇浓度下降并进一步刺激了HDL受体的合成［1］. 但本研究结果显示肾病综合征大鼠无论是否给予洛伐他汀治疗，其肝脏HDL受体mRNA表达水平均无显著变化，提示肾病综合征以及在肾病综合征中使用洛伐他汀治疗后肝脏HDL受体表达水平的改变可能发生在蛋白的合成或降解水平而非基因转录水平，其机制有待进一步探讨. 另外经洛伐他汀治疗后肾病综合征大鼠尿蛋白明显减少也可能部分和HDL胆固醇浓度的降低有关.
　　我们的研究结果表明，肾病综合征大鼠肝脏HDL受体蛋白表达水平降低，通过HMGCoA还原酶抑制剂洛伐他汀治疗后其表达得到明显改善，同时血清HDL胆固醇和总胆固醇浓度显著降低，因此肝脏HDL受体表达的改善在洛伐他汀降低肾病综合征高脂血症中发挥重要的作用.
【参考文献】
　　［1］Vaziri ND，Liang K. Effects of HMGCoA reductase inhibition on hepatic expression of key cholesterolregulatory enzymes and receptors in nephrotic syndrome［J］. Am J Nephrol， 2004，24(6):606-613.

　　［2］Okuda S， Oh Y， Tsuruda H， et al. Adriamycininduced nephropathy as a model of chronic progressive glomerular disease［J］. Kidney Int， 1986，29(2):502-510.

　　［3］Acton S， Rigotti A， Landschulz KT， et al. Identification of scavenger receptor SRBI as a high density lipoprotein receptor［J］. Science， 1996，271(5248):518-520.

　　［4］田德峰，洪斌，司书毅. 高密度脂蛋白及其受体的研究进展［J］.国外医学（药学分册），2003，30（1）：1-5.

　　［5］Liang K， Vaziri ND. Downregulation of hepatic highdensity lipoprotein receptor， SRB1，in nephrotic syndrome［J］.Kidney Int， 1999，56(2):621-626.