第一章 绪论
1.1 引言
种子是农业生产中最基本的生产资料，同时也是主要的农作物产品，关系整个农业的结构与发展。当前世界各国农业竞争逐渐集中到种子问题上。大力开展与提高种子研究水平，是农业生产发展的重要支撑。种子贮藏是寿命延续的关键，种子发育是提高品质和产量的基础（傅家瑞等，1993）。研究种子发育的调控机制，结合现有技术手段提高人类需要的某些物质含量，对提高农作物产量和品质具有重要的理论意义和应用价值（胡婷婷等，2021）。储藏过程中种子不断进行新陈代谢，所以研究和拓展种子储存技术，使储存条件达到种子休眠的平衡状态长期处于理想的生理状态，才能减少耗损并提高其后续的经济价值（于英杰等，2010）。
种子是植物最主要的繁殖器官和营养物质储存器官之一，高等植物种子的发育和成熟是其区别低等植物的一种进化优势，这使得大多数高等植物能够在环境胁迫下暂停生命周期并在有利环境条件下恢复生长，以应对不利的生存条件（Leónie et al，2008）。种子质量依赖种子组织（种皮、胚乳和胚）的完全发育，这些组织是各种营养物质的合成场所，并对种子起到保护作用；还依赖组织成熟过程中种子内如糖类和贮藏蛋白质等物质，这些物质代谢并转化各种贮藏化合物以供给种子成熟后储存和萌发消耗（Dubreucq et al，2010）。种子成熟进程和物质代谢受到多种如湿度、温度和光照等外部因素的影响，适宜的环境条件对植物各种生理活动都有益（Mugwedi et al，2018）。生长素（IAA，促进植物生根和子房发育等）、赤霉素（促进细胞伸长和解除种子萌发）、细胞分裂素（促进细胞分裂和芽分化和气孔开放）、脱落酸（ABA，促进叶和果实成熟并增强植物抗逆性）、乙烯（促进果实成熟和气孔关闭）和油菜素类固醇（促进茎、叶、根生长，植物光形态建成和增强环境胁迫的防御）等多种植物激素共同调控从植物种子萌发、营养生长到果实发育最终形成成熟果实和生活种子等许多生理生化过程（Monpara et al，2019）。基因和转录因子组成的复杂调控网络直接或间接对物质代谢合成起调控作用（Sreenivasulu et al，2013）。
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1.2 种子老化和黄酮类化合物
1.2.1 种子老化及其抗老化机理
种子是高等植物的最主要的营养和繁殖器官，然而随着储存时间的推移会逐渐老化，其活力降低甚至丧失发芽能力（Lehner et al，2008）。种子老化过程主要取决于其储存环境的温度和相对空气湿度（Ratajczak et al，2015），同时也与其各种代谢物质和种子内部结构相关（Arc et al，2011）。在种子贮藏过程中，种子不断地通过呼吸作用分解糖类、三酰甘油等生物分子，从而降低种子的寿命和种子的活力，且随着贮藏时间、环境温度和湿度的增加，活力降低幅度增大（Huang et al，2021）。老化大豆种子萌发早期脂肪酸分解代谢受阻，这是大豆种子贮藏后活力下降的主要原因（Wen et al，2019）。种子内部结构受损是种子老化的重要因素，线粒体结构的改变和抗氧化酶活性降低是种子老化的重要原因。种子老化过程中线粒体抗氧化酶如谷胱甘肽还原酶（GR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）等活性降低，并伴随线粒体内膜损伤（Mao et al，2018）。线粒体酶活性的大幅度下降限制了其呼吸能力，进而降低了萌发种子的能量（ATP）和同化物供应。因此，酶大分子结构的变化可能是导致发芽率降低的原因之一（Demirkaya et al，2010）。衰老的主要理论是哈曼提出的“自由基理论”，该理论假设自由基引起的损伤积累是所有生物衰老的潜在机制（Da et al，1956）。自由基是 ROS 的一种，除此之外 ROS 还包括羟自由基（OH-）和过氧化氢（H2O2），过量 ROS 积累将会引起氧化损伤、功能障碍、膜系统紊乱、线粒体蛋白、DNA 和脂质的氧化损伤（Ratajczak et al，2015）。线粒体是细胞生长和代谢最重要的能量来源，参与胞内多种氧化还原活动的同时会在细胞内积累大量 ROS 进而导致线粒体损伤影响其他细胞器功能，并且线粒体的呼吸机制基于氧化还原化学，能够对变化的条件做出敏感的反应，可据此判断细胞是否受到氧化损伤（Ratajczak et al，2019）。种子抗老化主要依赖细胞内的抗氧化酶系统以及细胞内的抗氧化剂（Mao et al，2018）。此外，白沙蒿种子表面富含粘液，可能有利于其在长期储存的情况下延缓种子老化。
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第二章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验材料
白沙蒿各发育阶段种子于 2016 年 8 月下旬至 10 月中旬在内蒙古阿拉善左旗荒漠（N：38°68’，E：105°61’）采集。其中白沙蒿各发育阶段种子从开花后第 10 天开始采集，每隔 10 天从植株的四面收获种子，直到种子成熟，最后共收集 7 个不同发育阶段的种子，分别命名为 S1-S7。同一个发育时期的种子被均匀混合，形成一个样品，每个发育时期样品三个生物重复。
2.1.2 试验仪器与试剂
试验所需的主要仪器为：烘箱（恒科技，中国），超声波清洗仪（鼎泰恒胜，中国），离心机（Eppendorf，德国），Agilent 1100 高效液相色谱仪（Agilent，美国），C18 反相色谱柱（4.6×150 mm，5 μm，Agilent，美国），C18 固相萃取小柱（Bond Elut，Agilent Technologies，美国），超纯水仪（Thermo Scientific，美国），NanoDrop ND1000（Thermo Scientific，美国），电泳仪（BIO-RAD，美国），实时定量 PCR 仪（BIO-RAD，美国），PCR 扩增仪（BIO-RAD，美国），金属浴（沃信，中国），水浴锅（力辰，中国），超低温冰箱（海尔，中国），移液枪（Eppendorf，德国）。
试验所需的主要试剂为：查尔酮、槲皮素、柚皮素、花旗松素、氯化矢车菊素和芹菜素标准品（纯度≥98%，阿拉丁，中国），芦丁标准品（纯度≥98%，百灵威，中国），甲醇（分析纯），乙腈（分析纯），磷酸（分析纯），Plant RNA Kit试剂盒（Omega Bio-Tek，美国），Prime-Script RT-PCR Kit 试剂盒（Takara，中国），SYBR Premix Ex Taq Kit 试剂盒（Takara，中国），线粒体分离和线粒体酶提取试剂盒（科铭，中国）。
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2.2 人工老化对种子的影响
2.2.1 种子老化处理
白沙蒿种子粘液去除：将完整的种子浸入水中 5-10 min，然后在滤纸上轻柔而快速地摩擦几次，直到种子吸水时没有粘液释放为止（Yang et al，2010）。
种子老化处理：白沙蒿完整种子及去粘液种子样本放置在 41℃和 100%相对湿度下的老化处理设备中连续处理 0 h（对照组）、24 h、48 h、72 h 和 96 h，对照组和每个处理组均有 3 个生物学重复（Tavakkol et al，2020）。
2.2.2 老化种子发芽率测定
根据杨等人的方法改进后用于白沙蒿种子培养：在直径为 90 mm 的封闭培养皿中，将 50 粒种子的在用 3 ml 蒸馏水润湿的两层滤纸上，在 25℃，连续荧光灯照射下培养。每 24 h 记录发芽（胚根萌芽长度为 2 mm，作为发芽完成的标准），并剔除已发芽的种子，对照和每个处理的种子最终发芽率以该组种子发芽率不再变化为准（Yang et al，2010）。
2.2.3 老化种子活力测定
氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定种子活力的原理：氧化还原反应是有活力的种子胚中发生的基本反应，将种子胚置入 TTC 溶液后，就会产生红色物质，被还原的 TTC 量与种子活力呈正比，种子活力越强，溶液红色越深，种子活性越弱，溶液红色越淡，因此 TTC 还原量可以间接反映种子活力。每个样品取 0.2 g 种子，为使种子充分吸涨将种子在清水中浸泡 2 h，软化后剥去种皮，置于试管，再加入 1% TTC 溶液 5 ml（以溶液浸没种子为准），用塞子密闭试管，在 35℃的黑暗条件下充分染色 2 h 后，倒出 TTC 溶液，用蒸馏水冲洗种子 2-3 次，并用滤纸吸取表面水分至干燥后，转移种子至新的干燥试管中，并添加 8-10 ml 无水乙醇至试管内，在 80℃水浴条件下持续加热试管（大约需要 8 h）以提取被还原的红色 TTC，注意随时添加无水乙醇至没过种子并注意开窗通风。当观察到种子胚变白时，说明提取完毕，立即将试管从水浴锅中取出。室温放置，待试管内提取液冷却后，将提取液倒入 10 ml 容量瓶并用无水乙醇定容，利用分光光度计测定定容后的提取液在 520 nm 处的吸光度值，代入标准曲线可得 TTC 还原量。
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第三章 结果与分析 ...................................... 17
3.1 人工老化对白沙蒿完整和去粘液种子活力指标的影响 ............................ 17
3.1.1 发芽率 .................................... 17
3.1.2 种子活力 .................................. 17
3.1.3 总黄酮含量 ........................................ 18
第四章 讨论 ....................................... 32
4.1 人工老化处理对种子活力的影响 ............................... 32
4.2 人工老化处理对总黄酮含量的影响 .................................... 32
4.3 人工老化处理对线粒体的影响 ......................................... 33
第五章 结论和展望 ................................ 39
5.1 主要结论 ................................................ 39
5.2 本研究的创新点 ................................. 39
5.3 研究展望 ..................................... 39
第四章 讨论
4.1 人工老化处理对种子活力的影响
种子老化是一种不可逆转的生理现象，即使种子储存在极其干净、干燥和低温的条件下，也很难完全防止其失活。种子发芽率是衡量种子活力的重要指标之一，活力高的种子由于其内部结构完整和营养物质充足，一般具有高发芽率（Pukacka et al，2007）。采后贮藏条件对种子品质和寿命有重要影响，种子中会发生各种生化和生理变化进而影响其活力，这些变化的速率主要取决于储存温度和空气相对湿度（Vujakovi et al，2019）。本研究中，对种子进行 41℃高温和100%高湿的不同时长人工老化处理，结果发现：完整和去粘液种子的发芽率均随老化处理的进程呈现持续下降趋势，老化 96 h 后，二者发芽率分别比对照下降 51.33%和 52.67%，但各处理时间下完整种子发芽率均高于去粘液种子，表明粘液可以延缓老化过程中发芽率的下降。值得注意的是，老化处理 24 h、48 h，完整种子活力与对照无显著差异，其活力于老化 72 h 出现显著下降，而去粘液种子的活力在老化过程中持续下降，这表明粘液在老化初期具有明显的延缓种子老化的作用。高温高湿条件下对 246 个品种大豆的种子进行人工老化后，其平均发芽率仅为对照组的 25.91%（Zhang et al，2019），对 3 个不同品种大豆进行老化处理 48 h 后，其种子活力分别下降下降 49.60%、38.76%和 43.96%（Ávila et al，2012），以上研究结果与本研究老化处理白沙蒿种子其发芽率和活力大幅度下降一致，进一步证明种子储藏环境的温度和湿度对其活力有很大影响，本研究的种子老化处理措施有效。白沙蒿种子的外表面含有一层果胶粘液层，在湿润时可以吸收大量的水分，能显著增加盐胁迫下白沙蒿种子的发芽率（Huang et al，2008）。本研究中，去粘液种子各老化处理时间下种子发芽率和种子活力均低于完整种子，表明粘液对白沙蒿种子受到的高温高湿胁迫起一定的保护作用，从而延缓种子老化。
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第五章 结论和展望
5.1 主要结论
（1）随老化时间延长，完整种子和去粘液种子发芽率、活力和线粒体 SOD酶活性均呈下降趋势，各指标去粘液种子均低于完整种子，表明去粘液种子更易老化失活。去粘液种子总黄酮含量下降幅度、线粒体总黄酮含量占种子总黄酮含量比例、线粒体的编码黄酮转运蛋白的 GST 基因表达量程度均高于完整种子，去粘液种子因老化程度更高故需要转运和消耗更多黄酮类化合物以抵御老化。
（2）白沙蒿种子黄酮类化合物含量为 15.05 mg/g，开花后 40-70 天是种子黄酮类化合物的快速积累期。成熟种子中黄酮类化合物组分包括黄酮醇（二氢槲皮素和槲皮素，45.78%）、查尔酮（查尔酮，23.17%）、黄酮（芹菜素，9.82%）、黄烷酮（柚皮素，14.03%）和花青素（矢车菊素，7.19%）。
（3）白沙蒿种子黄酮类化合物代谢路径直接受到结构基因和转录因子调控，植物激素和环境因素可能参与调控。黄酮代谢途径的关键调控结构基因包括 PAL、4CL、CHS、CHI、F3’H、FLS 和 UF3GT；MBW 复合体、SBP、C2H2、GATA、DREB、GTE、Trihelix 和 PIF 转录因子影响种子黄酮类化合物合成。
参考文献（略）