第1章绪论
1.1 研究的背景及意义
中国是世界蚕丝业的发祥地，蚕桑生产已有 5000 多年的悠久历史，农桑并举一直是漫长的封建社会历代君王奉行的基本国策，蚕丝业也一直是我国传统的出口创汇型产业。但是，中国蚕丝业是一个国际市场依存度最高的产业，内需比例较小，缺乏原动力。同时也是一个产业链较长的产业，既有种植业、养殖业，又有茧丝绸加工业，还有物流与国际贸易。尽管蚕丝素有“纤维皇后”之称，堪称人的“第二肌肤”，但由于蚕丝及其制品天然的一些特性，致使蚕丝总体需求保持相对的平衡与稳定。随着人们生活水平的逐渐提高与优化，蚕茧价格不仅没有像果、茶、蔬菜等其他经济作物的价格大幅上涨，反而因国际市场的需求时有较大的波动，蚕桑产业比较效益日益下降，而且极不稳定。也就是说，蚕桑产业一直依赖于茧丝绸对外贸易。传统的栽桑养蚕，只利用桑叶饲养家蚕生产蚕茧，每 667m2桑园年收入仅 2000-3000 元。因此，如何改变蚕桑生产依赖茧丝绸出口的历史局面，提高蚕桑生产的经济效益，保护蚕农的积极性，始终是困扰业内人士的一个难题。尽管我国早在上世纪 50 年代就已经开展蚕桑资源综合利用研究，但长期以来，蚕桑资源的开发利用以蚕桑副产物的综合利用为代表、是以副业的姿态出现在蚕桑产业链上，蚕桑资源的功能开发并未得到足够的重视[1-2]。近年来，向仲怀院士和业内专家领导曾多次提出，蚕桑生产要避免在一根丝上吊死，要跳出种桑养蚕缫丝织绸的单一产业链模式，确保蚕桑生产水平可持续发展的同时，要加强蚕桑产业资源的多元化利用、资源综合利用，甚至提出了发展栽桑业或桑树产业的概念与思路，以期着力提高蚕桑生产效益，增加农民收入[3]。
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1.2 国内外研究进展
糖类（saccharide）是多羟基（2 个以上）的醛类（aldehyde）或酮类（ketone）化合物。在化学上，由于其由碳、氢、氧元素构成，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”聚合，故又称之为碳水化合物（carbohydrate）。根据聚合度的多少，糖类可分为三类，即：单糖(monosaccharide) 如葡萄糖、果糖、核糖等、寡糖(oligosaccharide) 如麦芽糖、蔗糖、三糖、四糖等和多糖（polysaccharide）如糖原、淀粉、半纤维素等。糖还可以分为还原性糖和非还原性糖。还原性糖是指能够还原菲林试剂或托伦斯试剂的糖，其分子结构中含有还原性基团（如游离醛基或游离酮基）。在植物中，其多糖类主要是以纤维素和淀粉的形式存在，此外还含有多种单糖和寡糖。植物是人类碳水化合物的主要来源。水果中含碳水化合物约为 10%-20%，干果可达 50%-70%[13]。在桑椹中，转化糖中的比重占干重的 9%左右[14]。对于糖的测定方法有很多，主要分为三大类：物理法、物理化学法和化学方法[15]。针对不同种类的糖有不同的测定方法，而且在测定碳水化合物的时候，往往是使其先水解为糖后再进行测定。一般鉴定糖的种类常用的方法是薄层层析法，现在常用的精确测定糖的含量的方法是气相色谱法。气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品的用量少、准确高效等优点。当然，液相色谱也可以应用于对糖等化学物质进行定量和定性分析。随着科技的发展，色谱法已经不再是一种单纯的色谱分析法，国内外的一些专家已经将色谱和质谱等进行结合共同用来进行对物质的定量和定性分析[16-17]。Lillian 等[18]利用装有折光指数检测器的液相色谱对五种食用菌中的游离糖进行测定，并且通过对比指出，这五种食用菌存在着一定的同源性，甘露醇和海藻糖是它们共同含有的糖化合物。Chao 等[19]通过气相色谱法对土壤里的氨基糖进行检测和测定，测定出氨基糖中的单糖成分分别是葡萄糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺和胞壁酸。Hu 等[20]用气相色谱对刺楸叶中的糖分进行定量分析，经过测定，刺楸叶中的糖分占 60.37%。Sedat 等[21]将从希腊杨梅中提取出来的糖用气相色谱进行定量和定性分析，得出杨梅中总糖为 16.38g/100g，其中果糖 9.75g/100g，葡萄糖 5.33g/100g，蔗糖 1.19g/100g。Cevdet 等[22]在对松果进行物质化学成分分析的过程中，通过苯酚硫酸法测得松果籽中总糖的含量为 5.15%。Hela 等[23]将海藻粉末中的可溶性糖用乙醇提取，然后再用苯酚硫酸法进行检测。Beluhan 等[24]通过水提法将 10 种克罗地亚野生食用菌中的多糖进行提取，然后再用 HPLC 进行检测分析比较发现，其多糖含量在 42.62-66.78g/100g 之间变动，甘露糖醇和海藻糖含量最多。Amira 等[25]用超纯水将椰枣树果实中的糖分提取，然后通过 HPLC 进行检测。
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第2章桑椹菌核病病原菌的分离鉴定
桑椹菌核病不仅严重影响桑椹品质，而且可以说是“果桑”生产中毁灭性病害。近年来随着我国蚕桑产业供给侧改革的不断推进，果（桑椹）用专用桑和果叶（桑叶）兼用桑的种植面积在不断扩大，各地果桑产业面临桑椹菌核病危害问题日益突出，此病病势凶猛，流行频率高，传染扩大极快，在我国蚕区分布广泛，并有连年暴发的特点。桑椹一旦发病就无商品和食用价值，如果防治不当，可导致成片果桑园的桑椹“颗粒无收”，给果桑种植者带来巨大的经济损失。国内外研究认为，桑椹菌核病病原有桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)、肉阜状杯盘菌(Ciboria carunculoides)和核地杖菌(Scleromitrula shiraiana) 3 种，为此，我们对镇江地区发病果桑园进行采样，进行原菌的分离鉴定。
2.1 实验方法
将采取的菌核用无菌水表面冲洗干净，与分离用的无菌器材和分离培养基（PDA加入抑制细菌的广谱抗生素菌畏）置于超净工作台中，紫外条件下灭菌 30 min，将菌核用 75%酒精浸泡消毒 1 min，用无菌水冲洗后，用 5%有效浓度的次氯酸钠溶液消毒2 min 无菌水冲洗 5 遍，置于无菌滤纸上沥干，用无菌手术刀切去菌核内白色组织，置于分离培养基上，25℃，12 h 光照/12 h 黑暗培养，进行分离纯化。将培养分离的菌丝和菌核培养的子实体进行 DNA 提取和分子生物学鉴定。实验采集菌核萌发的不同种类型的子实体无菌水冲洗干净（从菌核分离菌丝），放入灭菌研钵中，液氮研磨，用真菌 DNA 提取试剂盒进行 DNA 的提取。
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2.2 结果与分析
从国家种质镇江桑树圃、镇江市丹徒世业州、句容发病果桑园采回病果（图 2.1）进行分离，通过 ITS 序列测序鉴定，获得桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)、肉阜状杯盘菌(Ciboria carunculoides)和核地杖菌(Scleromitrula shiraiana) 3 种菌株。三种类型的子实体，经分子鉴定为：子实 a 菌株与核地杖菌（ScleromitrμLashiraiana strain）同源性高达 99%；子实体 b 菌株与肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoidesstrain）同源性高达 98%；子实体 c 菌株与桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana strain）同源性高达 99%(表 2.3)，这三种菌均为桑椹菌核病致病菌[9, 12, 14, 83]。采用 MEGA 6.0 软件对子实体 a,b 和 c 与其相关菌进行同源性分析，使用 Neighbor-Joining 方法构建系统发育树如图 2.3，发现 a 和 b 菌株亲缘关系较近。
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第 3 章 桑椹致腐性真菌的分离与鉴定.......26
3.1 实验材料 ........ 26
3.2 实验方法 ......... 26
3.3 实验结果与分析 ...... 27
3.3.1 桑椹致腐菌的分离培养 ..... 27
3.3.2 分离菌株的致腐性验证 ..... 28
3.3.3 致腐菌分子生物学鉴定和菌丝形态观察 .... 28
3.4 讨论 ........ 30
第 4 章 桑椹菌核病生防真菌的分离与田间防控效果..........31
4.1 实验材料 ........ 31
4.1.1 土样来源 .......... 31
4.1.2 培养基 ..... 31
4.1.3 主要药品及试剂 ....... 31
4.1.4 主要仪器与设备 ........ 32
4.2 试验方法 ........ 32
4.3 结果与分析 .... 35
4.4 讨论 ........ 43
第 5 章 生防微生物采后处理对桑椹品质的影响.........45
5.1 材料与方法 ..... 45
5.2 实验方法 ........ 47
5.3 实验结果与分析 ...... 50
5.4 讨论 ....... 56
第8章桑树果用性状的关联分析
作物中大部分农艺性状属于数量性状，目前，研究农作物数量性状遗传学基础的主要方法有两种，分别是使用分子标记覆盖整个基因组的连锁分析以及在家系分离种群的基础上进行连锁分析[156]。关联分析(association analysis)是建立在连锁不平衡(1inkage disequilibrium，LD)的基础上，能够识别群体内目标性状与候选基因或遗传标记之间的关系。Inter-simple sequence repeats (ISSR) 分子标记已广泛用于桑树种质资源的遗传多样性等分析[169-170]，本文利用关联作图方法，进行了桑树果用性状和标记的关联作图。
8.1 材料与方法
15 个 ISSR 引物共扩增出 104 条带，不同引物的扩增带数变幅在 3-11 之间，平均每个引物可扩增出 6.93 条带。104 条带中有 94 条带具有多态性，占 90.38%，每个引物可扩增出 3-10 条多态性条带，平均为 6.4 条，（见表 8.2、图 8.2）。ISSR 标记的位点的多态性信息含量(PIC)值为 0.0210-0.5919，平均为 0.2698。平均每个位点观测等位基因数为 1.9524，有效等位基因数为 1.5468，Nei's 遗传多样性指数为 0.2979，遗传多样性指数为 0.3253，相传相似系数 0.4881-0.9643，平均 0.7201，这表明供试果桑材料之间的 ISSR 变异大，多态性高。根据 ISSR 标记遗传相似系数按 UPGMA 法对 93 个桑树品种进行了聚类分析（图8.3）。从聚类结果来看，具有相同杂交亲本及相同生态类型的大部分桑树品种聚为一类。在特定的 k 值独立运行 5 次，估算似然值，但是平均 L(K)并没有发现真真的 k 值（图 8.4），所应用 ΔK(Evanno et al., 2005)。本研究中，最高 ΔK 为 4（图 8.5），因此亚群体结构为 4 用于基于结构的关联分析。
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结论
桑椹（或者桑葚）又叫桑果、桑枣，是桑树的成熟果实。桑椹属于浆果类，生物活性物质含量丰富，营养价值较高，被世人誉为“21 世纪最佳的保健果品”之一。采前桑椹菌核病和采后果实腐生性病害是影响桑椹产量和品质非常重要的一个原因。本文主要对桑椹病原真菌的分离鉴定，生防微生物对桑椹保鲜及品质影响等桑椹防腐保鲜技术，以及桑树果用性状分子标记进行了研究。
1. 从桑园采集的桑椹菌核病菌核在土壤中培养产生三种不同形状的子实体，通过形态和分子鉴定为桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana），核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides strain）。
2. 从采后腐烂桑椹上分离获得三株桑椹致腐性真菌，分别是葡萄孢属（Botrytisspp）霉菌，匐枝根霉（Rhizopus stolonifer spp.）菌和毛霉属（Mucor spp.）霉菌；研究了 TR16、TR66 和 BS 对桑椹致腐菌具有拮抗活性，结果表明 TR16 和 TR66 比桑椹致腐菌空间定殖能力≧50%，对峙培养对致腐菌菌丝生长抑制率为 60%-80%；研究了TR16，TR66 和 BS 的发酵滤液和孢子悬液采后处理对桑椹品质的影响，结果表明壳聚糖处理桑椹后显著性抑制采后水果腐烂率、失重率、可溶性固形物和抗坏血酸含量的损失，花青素、黄酮、总酚抗氧化物质的含量和抗氧化活性比对照组显著性的提高。
3. 以中桑 5801 为材料，研究了生防菌木霉对桑椹菌核病的防控效果。从桑椹菌核病发病桑园桑树根围土壤中分离得到 48 株木霉，经鉴定分属于木霉组、厚基孢组、长枝组和肉座组；通过对峙培养法从 48 株木霉中筛选出 20 株对桑椹菌核病病原菌具有较强空间竞争能力的菌株；采用玻璃纸法研究这 20 株木霉菌株的代谢物质对桑椹菌核病病原菌生长的抑制作用；从中筛选出 3 株不同种、拮抗潜能最好的木霉菌株进行桑椹菌核病田间防效试验，发现 Tr16、Tr50 木霉发酵液对桑椹菌核病的防控作用较好；在桑椹采前喷施壳聚糖、冠菌素、桑黄多糖、木霉发酵液等诱导子，发现 4 种诱导子处理对桑椹果实酚类和黄酮含量的积累有一定影响，而对总糖的含量影响不大，4 种诱导子对桑椹总多酚的效果为Tr16发酵原液> 0.5 g/L CTS > 0.01 μmol/L COR> 0.1 g/L桑黄多糖>CK，4 种诱导子对桑椹总黄酮的效果为 Tr16 发酵原液> 0.1g/L CTS >0.01μmol/L COR> 0.1 g/L 桑黄多糖；利用 4 种外源诱导子处理新鲜桑椹，研究其对果实贮藏品质的影响，结果表明：Tr16 木霉发酵原液、0.1 g/L 壳聚糖、0.001 μmol/L 冠菌素处理能够很好的保持桑椹果实的糖含量，而桑黄多糖对桑椹糖含量的保持较短，木霉发酵液稀释 10 倍和原液处理、0.1g/L 壳聚糖处理、冠菌素处理能够较好的保持总黄酮含量。
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参考文献（略）