本文是一篇药学论文，本研究首次采用气泡辅助双水相法结合高速逆流色谱提取分离五味子中的活性成分，之前未有文献进行报道。本实验的结果证明该方法是一种绿色高效的提取溶剂，适用于天然产物活性成分的提取分离，具有良好的应用前景及工业化应用的潜力。
1绪论
1.1五味子简介
五味子是多年生木兰科藤本植物,为五味子的干燥成熟果实[1]。按照产区、价格、功能等的不同分为五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)和华中五味子(Schisandrasphenanthera Rehd.et Wils.),前者又称"北五味子"，后者又名"南五味子"[2]。通常生长在中国东北地区、内蒙、河北、宁夏、甘肃等地,黑龙江、吉林、辽宁三省为北五味子主要分布区域。五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效，常用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，心悸失眠[3]。五味子最初记录在《神农本草经》,是中国有名的传统中草药,由于五味子中具有大量的木脂素,挥发性油类,有机酸多糖等化学物质[4],有着大量的药理作用和巨大的经济发展前景,因此本文将对五味子中主要木脂素类化合物进行了提取分离研究。
1.1.1植物学研究
五味子是木兰科藤本植物，高达8cm-15cm。茎柔软且坚韧，缠绕于其它乔、灌木上生长，在林中属层间植物。果实为聚合桨果，似球形，成熟时颜色呈现鲜红色，直径约1cm大小，果实内包含1-2颗种子，呈肾形，淡黄色，表面光滑。五味子花期在5-6月，果期在8-9月[5]。
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1.2五味子木脂素成分研究现状
1.2.1物理性质及组成结构
五味子中木脂素多为白色或无色结晶，沸点高，不易挥发，且多为小极性化合物，难溶于水，可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、氯仿等溶剂[48]。
五味子木脂素根据结构，可分为以下五大类：联苯环辛二烯木脂素、螺苯骈呋喃联苯环辛二烯木脂素、4-芳基-四氢萘木脂素、2,3-二甲基-1,4-二芳基丁烷木脂素和2,5-二芳基四氢呋喃木脂素[49]。其中，联苯环辛二烯木脂素是五味子最主要的活性成分。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素等多许多物质都属于这类木脂素。
1.2.2提取方法
1.2.2.1溶剂提取法
溶剂提取法是最常用的提取植物活性成分的方法。它是一种依据不同成分在特定溶剂中溶解度的差异，使其完全或部分分离，而将目标成分从植物中提取分离的方法。主要包括回流法、热提法，冷凝回流法及索氏提取法等[48]。叶殷殷[50]等人以乙醇为提取溶剂，通过热回流提取法，最终得到木脂素提取率为8.953mg/g。
1.2.2.2超声波提取法
超声波提取是采用超声波辅助溶剂进行提取，超声波通过剧烈的空化效应，从而破坏植物细胞壁，使提取溶剂与植物充分反应而进入细胞内，加速反应进程。张丙云等[51]通过超声波提取法对竹叶椒中的木脂素类成分进行提取，并对其条件进行优化，最终总木脂素得率为3.406%。
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2五味子中七种活性成分分析方法的建立
2.1实验部分
2.1.1实验仪器与设备
对于天然药用植物中活性成分，建立灵敏高效、快速准确的分析检测方法是十分必要的。目前，诸多分析技术已经被用于植物中活性成分的定性定量检测，其中高效液相色谱（HPLC）是最常见的分析方法，因其具备检测迅速灵敏、高分离能力、适用范围广等特点，已广泛被应用于天然产物目标成分的分析检测。
本研究采用HPLC对五味子中七种目标成分，即五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素及五味子并素进行分析检测。通过对色谱条件的优化，该方法灵敏度高、稳定性和重复性良好、检测限及定量限低，适用于五味子中主要活性成分的定性及定量控制，为五味子中活性成分的分离以及检测提供了参考。
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2.2结果与讨论
2.2.1高效液相色谱方法的建立
2.2.1.1流动相的选择
在HPLC分析方法中流动相的组成非常重要，在本实验中，研究了甲醇-水和乙腈-水的流动相体系对色谱峰分离的影响，实验结果证明，当液体流动相体系为乙腈-水时，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素及其他杂质物质具有良好的分离效果，且峰形尖锐对称，没有明显的前沿峰及拖尾峰出现，但色谱峰浮动在总基线之上。
实验证明，在流动相中加入少量酸可以提高流动相的离子强度，有效改善色谱峰形和对称性，起到防止拖尾的作用。因此，在纯水系统中加入不同浓度的甲酸（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%），分析检测，通过标准溶液峰色谱分离效果观察发现，加入0.1%甲酸水溶液能有效改善峰形，基线平坦，峰时间不变。因此0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)被选为最佳流动相体系。优化后的液相色谱梯度洗脱条件为：梯度洗脱，0–35 min,40%−75%B;35–45 min,75%−80%B；检测波长：254 nm，流速：1 mL/min，柱温：30℃，进样量：5μL。
2.2.2方法学验证
按照2.1.3部分制得五味子样品溶液的HPLC色谱图如图2-2(A)所示。从图中可以看出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素与其他物质基线分离，具有良好的分离效果。但还需要进一步的方法学考察以验证该色谱分析方法是否符合分析检测要求。
方法学验证的内容主要包括以下几个部分：线性范围(Linearity range)、检测限(Limitof detection,LOD)、定量限(Limit of quantitation,LOQ)、重复性(Repeatablity)、精密度(Precision)、稳定性(Stability))和回收率(Recovery)。
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3五味子中木脂素类成分绿色提取工艺研究...................................14
3.1实验部分..............................14
3.1.1实验仪器与试剂..................................14
3.1.2提取率计算....................................15
4高速逆流色谱分离五味子中主要木脂素成分.........................29
4.1实验部分.................................29
4.1.1实验仪器与试剂...............................29
4.1.2粗提物制备................................30
结论.........................................38
4高速逆流色谱分离五味子中主要木脂素成分
4.1实验部分
4.1.1实验仪器与试剂
研究结果表明五味子中含有大量木脂素类化合物，目前对于五味子中木脂素类化合物的分离纯化方法主要采用硅胶色谱法、薄层色谱法、大孔吸附树脂富集分离等，这些传统的方法具有不可逆性吸附、分离效率低、成本高、等缺点。木脂素是一种小极性分子，作为五味子保肝的主要活性成分，选择一种高效的方法分离是必要的。高速逆流色谱是一种连续的液-液分配色谱，具有不可逆性吸附、成本低、效率高等优点，适合天然产物活性成分的制备分离。
本研究建立了一种能够高效快速分离纯化五味子中木脂素类的高速逆流色谱方法。实验对高速逆流色谱的两相溶剂体系进行了筛选，找到了适合小分子木脂素成分，即联苯环辛二烯类化合物的逆流色谱溶剂体系，并对分离的得到的单体进行HPLC及质谱的分析鉴定。
药学论文参考
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结论
本论文建立了五味子中主要活性成分木脂素类化合物的HPLC检测方法；通过五味子中七种目标成分的提取影响因素的研究，优化了气泡辅助双水相浮选提取工艺；并建立了目标化合物的高速逆流色谱分离方法。主要的研究成果如下：
1.建立了一种新的快速测定五味子提取物中多种活性成分的高效液相分析方法。该检测方法操作简单、快速、分析时间缩短、节省溶剂。检测成本大幅度缩减，并且该方法灵敏度高、重复性好、精密度高、稳定性强。
2.以五味子中7种目标成分为提取目标物，首先通过单因素实验筛选出新型高效的气泡辅助双水相浮选提取工艺，设计BBD实验,，应用响应面法首次系统研究了盐浓度、醇浓度、浮选时间、浮选速率对气泡辅助双水相浮选提取五味子中目标化合物的影响。在最优工艺条件下，结果显示SZA、SZB、SSA、SSB、SA、SB及SC提取率分别为8.77mg/g,2.15mg/g,0.88mg/g,0.68 mg/g,1.33 mg/g,2.91 mg/g and 0.18 mg/g；提取率高于传统有机溶剂提取方法1.47倍。通过对比传统的提取方法，发现ATPF技术的优点，是一种快速高效、工艺简单且能耗低的提取技术，远高于超声辅助传统有机溶剂的提取率，且不会对化合物的稳定性产生影响，因此具有广阔的应用前景。
3.通过高速逆流色谱分离技术经过分离，从五味子中共分离得到4种化合物即五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙和五味子乙素。其纯度都大于95%,HSCCC分离过程的回收率都高于90%。证明该逆流工艺首次用于五味子中木脂素类成分的制备分离，具有操作简单、分离效率高、产品纯度高、耗时少、易规模化制备的优点。
本研究首次采用气泡辅助双水相法结合高速逆流色谱提取分离五味子中的活性成分，之前未有文献进行报道。本实验的结果证明该方法是一种绿色高效的提取溶剂，适用于天然产物活性成分的提取分离，具有良好的应用前景及工业化应用的潜力。
参考文献（略）