第一部分 柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶基因的鉴定与克隆
1 材料与方法
1.1 实验材料与处理
本实验以种植于四川省乐山市沙湾区，在遮阴度为 75%的遮阴网下的两年生柔毛淫羊藿（E. pubescens）为材料。采摘新展开的叶子，双蒸水清洗后用锡箔纸包裹，立刻置于液氮中速冻。取适量叶片材料送到北京百迈客生物科技有限公司进行基因组测序，其余部分置于-80℃冰箱中保存，用于后续 RNA 提取。取柔毛淫羊藿的不同组织（根、茎、叶、花和果实），双蒸水清洗后用锡箔纸包裹，立刻置于液氮中速冻，然后送到北京中兴博迈科技有限公司进行转录组测序。
1.2 实验试剂与仪器
1.2.1 实验试剂
Eastep® Super 总 RNA 提取试剂盒（上海普洛麦格生物产品有限公司，LS1040）FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（天根生化科技（北京）有限公司，KR118-02）dNTP Solution Mix（美国 NEB 公司，N0447L）Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（美国 NEB 公司，M0491L）Trans2K® DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司，BM101） 50×TAE 缓冲溶液（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，NEP030） Goldview 核酸染料（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DH392-5） 6×Loading Buffer（宝日医生物技术（北京）有限公司，9156） AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（康宁生命科学（吴江）有限公司，GX-250） 零背景 pTOPO-Blunt simple 平末端克隆试剂盒（北京兰易科技有限公司，LY-0017） 2×Taq MasterMix（Dye）（北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682M） Trans1-T1 感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司，CD501） 琼脂糖（生工生物工程（上海）股份有限公司，A600174） 无水乙醇和氯化钠（分析纯，北京化工厂） 胰蛋白胨和酵母提取物（英国 Oxoid 公司）
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2 结果
2.1 EpPTs 的鉴定和系统发育分析
通过搜索柔毛淫羊藿基因组本地蛋白数据库，共得到 28 条蛋白序列，进一步通过搜索 PFAM 及 NCBI Batch CD-search 在线数据库，分析蛋白序列及 UbiA 保守结构域，去掉 3 个不含 UbiA 保守结构域的序列，共鉴定出 24 个 EpPTs。其中定位到染色体上的有 22 条，其余 2 条分布在两条 contig 上（图 1-1）。EpPTs 基因在 6 条染色体上分布不均匀，其中分布在 3 号染色体上的基因最多，有 10 个，其中有 9 个在染色体的顶端形成一个基因簇，推测该基因簇通过基因复制产生；其次是 6 号染色体和 5号染色体，分别有 4 个和 3 个 EpP Ts 基因；1 号染色体和 2 号染色体上分别有 2 个EpPTs 基因，4 号染色体上有 1 个 EpPT 基因。
用获得的 49 条大豆 UbiA PTs、6 条拟南芥 UbiA PTs、以及目前已报道的 54 条植物 UbiA PTs 氨基酸序列，与淫羊藿基因组中的 24 条 EpPTs 氨基酸序列一起用于构建系统进化树（图 1-2），相关蛋白的登录号列于附表 1。系统发育分析显示，植物 UbiAPTs 分为两大类[9]：一类为参与初级代谢产物（如生育酚，生育三烯酚、质体醌、叶绿素、叶绿醌、血红素和泛醌）生物合成的 UbiA PTs，按照生物学功能分类，每个类别里来自不同植物科属的基因均聚在一起。另一类为参与植物重要次生代谢物如类黄酮、香豆素和间苯三酚衍生物等生物合成的 PHPTs（polyphenols PTs），与参与维生素 E 和质体醌生物合成的 HGPT 家族聚在一起，成了独特的进化枝，不同植物类群如桑科、豆科和大麻科独立进化，分别聚为一支。
进一步分析，EpPTs 分为 7 个组，其中与已报道的生育酚、生育三烯酚、质体醌、叶绿素、叶绿醌、血红素和泛醌生物合成基因聚在一起的分别有 2 个、3 个、2 个、2个、1 个、2 个和 1 个。此外，有 10 个 EpPTs 聚在一起形成一个单独的分支，表明这一组基因的极度扩张，鉴于已经发现的 PHPTs 都呈现独立发生的趋势，以及淫羊藿中种类丰富和高含量的带异戊烯基类黄酮成分的存在，推断这 10 个基因为柔毛淫羊藿的 FPTs 候选基因。在这 10 个基因中，有 6 个基因（EVM0022490、EVM0033754、EVM0031923、EVM0036836、EVM0011343 和 EVM0018117）位于 3 号染色体的顶端，形成一个基因簇。另外有 1 个 EpPT（EVM0032839）与芸香科 Cl-PT1 聚在一起，该基因与 EVM0010669（上述 10 条中的 1 条）位于 5 号染色体，所以将 EVM0032839与上述 10 个候选基因一起，用于后续的功能研究。
药学论文参考
第二部分 柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶的功能分析
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
测序正确的转入 pTOPO-Blunt simple-EpPTs 载体的大肠杆菌单克隆菌液 酵母表达载体 pDR196GW 和 DD104 型酵母菌株（中国科学院遗传与发育生物学研究所王国栋课题组赠送） pDR196GW-LaPT2 载体（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所庞永珍课题组赠送） Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（美国 NEB 公司，M0491L） dNTP Solution Mix（10 mM）（美国 NEB 公司，N0447L）AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（康宁生命科学（吴江）有限公司，GX-250） AxyPrep 质粒 DNA 小量试剂盒（康宁生命科学（吴江）有限公司，AP-MN-P-250） pENTR™ / D-TOPO™ Cloning Kit（英潍捷基（上海）贸易有限公司，K240020） Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix（英潍捷基（上海）贸易有限公司，11791100） TE buffer（pH 8.0）（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，NEP029） 无水乙醇和氯化钠（分析纯，北京化工厂） 胰蛋白胨和酵母提取物 D-葡萄糖（英国 Oxoid 公司） YPAD（Yeast Extract Peptone Adenine Dextrose Medium）、酵母合成缺陷型/尿嘧啶缺陷型培养基（Ura Minus Media）、1 M LiAc 溶液（北京泛基诺科技有限公司） PEG 3350（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司） 类黄酮底物标准品（上海源叶生物科技有限公司） 氯化钠和二甲基亚砜（DMSO）（分析纯，北京化工厂） 乙腈和甲醇（色谱纯，Fisher，美国） 纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司） 其它试剂见“第一部分 1.2.1 实验试剂”
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2 结果
2.1 候选基因的完整蛋白编码序列及不含转运肽的截短序列扩增
本研究的第一部分采用巢式 PCR 技术，从柔毛淫羊藿叶片 cD NA 中成功扩增得到 7 条类黄酮异戊烯基转移酶候选基因，包括 EpPT1a、EpPT1b、EpPT2、EpPT3、EpPT4、EpPT5 和 EpPT6，以及人工合成的 EpPT7。本章节主要针对这 8 个候选基因的功能进行研究。植物 FPTs 的 N 端有一段靶向到质体的转运肽，研究发现，在酵母表达系统中，转运肽的存在会使 FPTs 编码蛋白部分或全失去活性[31, 42]。对大豆中GmPT01 的研究发现，完整蛋白编码序列和去掉 26 个氨基酸转运肽的截短蛋白编序列没有活性，而去掉 21 个氨基酸转运肽的截短蛋白序列有活性[30, 43]，说明转运肽的存在与否，以及预测转运肽的长度，对基因功能验证产生的影响不同。为了系统研究每个 EpPTs 的功能，本研究根据预测的转运肽大小，扩增了完整蛋白编码序列以及两种不含转运肽的截短蛋白编码序列 EpPT△TPs，基因名称参见表 2-1，候选基因的完整蛋白编码序列及不含转运肽的截短序列扩增结果见图 2-1。
药学论文怎么写
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第二部分 柔毛淫羊藿类黄酮异戊烯基转移酶的功能分析 ................................... 27
1 材料与方法 ............................... 27
1.1 实验材料与试剂........................................ 27
1.2 主要仪器..................................... 28
1.3 实验方法................................. 28
2 结 果 .................................... 35
2.1 候选基因的完整蛋白编码序列及不含转运肽的截短序列扩增................ 35
2.2 pDR196GW-EpPTs / EpPT△TPs 酵母表达载体的构建和酵母转化 ......... 36
2.3 酵母与类黄酮底物的孵育反应........................................ 37
3 讨 论 ....................... 41
3.1 EpPT2 体外酶活特征分析 ......................................... 41
3.2 转运肽序列对酶活性的影响.............................. 43
3 讨论
3.1 EpPT2 体外酶活性特征分析
黄酮醇类是植物植物界分布最为广泛的类黄酮，但具有异戊酰基取代的黄酮醇较少，在植物中也含量很低。白羽扇豆中发现的 LaPT2 是目前鉴定出的第一个以黄酮醇为最适底物的植物类黄酮异戊烯基转移酶，可以催化多种黄酮醇苷元，包括山奈酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、杨梅素（Myricetin）、桑色素（Morin）、山奈素（Kaempferide）、高良姜素（Galangin）和漆黄素（Fesitin），此外还对柚皮素（Naringenin，二氢黄酮）有微弱的催化活性。苷元结构中的 4’、5 和 7 位羟基取代对 LaPT2 与底物结合很重要，三个羟基全部缺失后不能作为 LaPT2 的底物，单独缺失 4' 或 5 羟基的黄酮醇苷元均可作为 LaP T2 的底物。B 环中羟基的数目和位置会影响 LaPT2 的催化效率，B 环羟基越多，LaPT2 的催化效率越低，LaPT2 对 B 环羟基呈间位分布的黄酮醇苷元的催化效率低于 B 环羟基呈邻位分布黄酮醇苷元。此外还发现 4' 羟基甲基化后也会降低 LaP T2 对的催化效率[41]。
本研究证明 EpPT2 以黄酮醇苷元为最适底物，主要催化山奈酚生成异戊烯基山奈酚，还可催化槲皮素和芹菜素，生成少量的产物。从催化底物的结构来看，这三类化合物均有 4'、5 和 7 位羟基，但芹菜素属于黄酮，因此，这三个羟基以及 3 位羟基对 EpPT2 催化效率的影响，还需进一步研究。就 B 环羟基的数目而言，EpPT2 对山奈酚（B 环一个羟基）有很高的催化效率，对槲皮素（B 环两个羟基）的催化效率明显低于 LaP T2，对杨梅素（B 环 3 个羟基）没有催化活性，说明 B 环羟基数目会影响EpPT2 的催化效率。此外，EpPT2 对山奈素（山奈酚的 4'-OH 甲基化）和柽柳黄素（槲皮素的 4’-OH 甲基化）没有活性，推测在淫羊藿苷类黄酮的合成过程中，异戊烯基化反应要早于甲基化反应。本研究发现的 EpPT2 和已报道的 LaPT2 均以黄酮醇苷元为最适底物，但相比于 LaP T2，EpPT2 具有更严格的底物特异性。
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4 结论
本研究扩增得到8个柔毛淫羊藿FPT候选基因的完整蛋白编码序列EpPTs和不含转 运 肽 的 截 短 基 因 序 列 EpPT △ TPs ， 构 建 了 部 分 基 因 的 酵 母 表 达 载 体pDR196GW-EpPTs / EpPT△TPs。通过酶活实验，鉴定EpPT2是一个黄酮醇异戊烯基转移酶，以山奈酚为最适底物，催化其生成异戊烯基山奈酚。此外EpPT2还可催化槲皮素和芹菜素的异戊烯基化反应。研究结果显示苷元基本结构中羟基数目和位置影响酶的催化效率，并推测淫羊藿类黄酮的生物合成过程中，异戊烯基化反应要早于甲基化反应。本研究为淫羊藿中其他FPTs的研究奠定基础，为进一步解析淫羊藿类黄酮生物合成途径提供依据，使通过体外生物合成有价值的异戊烯基黄酮醇成为可能。
参考文献（略）