本文是一篇药学论文，本论文在研究 PDNPs 的衍生物作为抗氧化的生物材料方面还需要一定的实验支撑，如论证材料是否能够清除其他因素诱导产生的细胞氧化损伤，同时若有更多相应的模型的动物实验会使整个研究更加完整可靠。在研究 PDNPs 的衍生物材料时，进行了两次筛选，只是基于本论文后期的实验需求所筛选的，其他条件的材料并没有进行深入的研究与探索，它们的功能仍然需要进行论证。
第一章 绪论
1.1 活性氧物种
活性氧物种(reactive oxygen species，ROS)是指含氧且具有一个或多个未配对电子的不稳定物质。自从在生物环境中发现以来，ROS 的化学活性、生理活性以及病理活性都引起了科学家们的研究兴趣[1]。在正常生理状态下，细胞内 ROS 的产生和清除处于动态平衡状态，这对于机体抵抗外来病原体、传递细胞信号具有重要意义（图 1-1）。在正常状态下，ROS 可参与机体内的许多生理反应，在多种信号级联中起着重要的调节作用。例如，刺激生长因子和调节炎症反应[2]。ROS 还参与调节多种细胞生理过程，包括分化、增殖、生长、凋亡、细胞骨架调节、迁移和收缩[3]等。当机体所处环境发生变化，诸如长时间暴露在高温、紫外线或强电离辐射、器官缺血再灌注、脓毒血症等，都会使机体或细胞内信号发生变化，ROS 水平会在短时间内骤然提高[4-9]。具有未配对的活泼自由电子、化学反应活性极强的 ROS 此时会导致细胞结构损坏和破坏基因组的稳定性。机体内过度累积的 ROS，会造成细胞、器官乃至机体产生氧化应激反应，影响机体的正常生理代谢，不仅会导致器官功能出现障碍，还会促使多种疾病的发生和发展，产生多种并发症[10]。
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1.2 体内ROS的种类和来源
机体产生的 ROS 有过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2•−）、一氧化氮自由基（•NO）等[11]。它们都有不成对的电子或者活泼不稳定的键，具有极强的反应活性。一般来说，ROS 的存在时间很短，在高浓度下能与细胞成分中的脂类、核酸和蛋白质等多种物质发生一系列连锁反应，造成不可逆的功能损伤，主要包括脂质过氧化[12]、蛋白损伤导致酶失活[13]和 DNA 损伤造成的基因突变[14]。同时，在反应过程中，它们还能够产生毒性更强的二级产物，包括羟基自由基（•OH）、单线态氧（1O2）、次氯酸（HOCl）和过氧亚硝酸根（OONO−）等，进一步加剧机体的损伤程度（图 1-2）。
机体产生的 ROS 主要来源于细胞的呼吸和代谢过程。在细胞呼吸过程中，氧通过单个电子的连续转移而减少，具有奇数电子的中间体可以从呼吸链中逸出，从而产生具有不稳定电子对或者活泼键的 ROS。产生 ROS 的主要位置是线粒体中的呼吸复合链（图1-3）。人体每天总耗氧量的 1-2%会在线粒体转化为 O2•−[16]，释放到线粒体基质中。当人体处于健康状态时，机体内处于平衡状态的 ROS 各司其职，保证机体正常生理活动的进行，不会造成氧化应激损伤。此时，机体内产生的 ROS 主要来源于三羧酸循环中和呼吸链中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH Ⅱ）。琥珀酸是三羧酸循环的中间产物，也是机体缺血再灌注应激损伤后的特征代谢物。因此可以采用抑制琥珀酸的生成或者减少 ROS 的含量来缓解缺血性器官损伤。NADPH Ⅱ在三羧酸循环中发挥作用。NADPH Ⅱ 通过减少线粒体膜中泛醌的含量将琥珀酸转化为延胡索酸；同时琥珀酸还能够再氧化，通过线粒体的反向电子传递生成 ROS。NADPH Ⅰ 是产生过量 ROS 的主要来源。NADPH Ⅰ 产生的 ROS 包括半醌、黄素单核苷酸、铁硫簇和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[17,18]。大量的酶（黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合成酶、细胞色素 P450）在参与机体代谢过程中产生 ROS，如在细胞色素 P450 介导催化的脂肪酸氧化过程中，氧气会被还原或者接受从黄素蛋白逃逸的电子，产生 ROS。有些细胞器也会生成 ROS，如过氧化物酶体的主要功能是消耗细胞质中的 H2O2，但当过氧化物酶体处于衰老阶段，功能降低，此时高能电子转移至过氧化物酶体，但其无法及时转换电子，导致 ROS 的增加。
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第二章 PDNPs衍生物的制备表征及应用
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
尽管科学家已经通过许多先进的分析表征手段对天然黑色素的化学结构进行研究，但是由于黑色素的来源、大小、颜色和功能的多种多样，至今黑色素的分子结构仍未被阐明清晰，因而很难确定天然黑色素所具备的所有特征是否能在提取过程中不受到破坏。有球形或椭圆形形状的天然黑色素已经可以通过从生物来源（例如墨鱼墨汁[91]、黑芝麻[92]和黑木耳[93]等）中提取和纯化获得，但现在的提取和纯化技术较人工合成方法更复杂、成本更高。PDNPs 具有与黑色素接近的理化性质，是代替天然黑色素的有效材料。综上所述，人工合成类黑色素材料有很大的研究应用价值。目前关于人工合成超小尺寸的类黑色素材料 PDNPs 的方法和不同量的 PEG-NH2修饰是否会对 PDNPs 的作用效果产生影响报道较少。
针对上述问题，本章改进现有合成方法，控制 PDNPs 的尺寸大小，通过不同量PEG-NH2 表面修饰策略对 PDNPs 进行修饰，探索不同表面修饰策略对 PDNPs 作用效果影响，筛选符合后期实验需求的 PEG-NH2修饰量。
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2.2 实验方法
2.2.1 PDNPs 的合成
在 250 mL 圆底烧瓶中加入 90 mL 超纯水和 40 mL 无水乙醇，然后将 2 mL 的氨水加入到上述溶液中，在 30/40/50 ℃下磁力搅拌至少 30 min。在搅拌后的溶液里面加入10 mL 的盐酸多巴胺水溶液（50 mg/mL），烧瓶中的溶液由无色-淡黄色-深棕色发生变化。反应进行 24 h 后，得到不同粒度大小的 PDNPs，分别标记为 PDNPs-1、PDNPs-2 和PDNPs-3 透析纯化分离。
2.2.2 PDNPs 的标准曲线
将纯化的 PDNPs 溶液冻干后得到 PDNPs 粉末，称取一定量的粉末完全溶于超纯水中检测 PDNPs 在 808 nm 处的吸光度，绘制标准曲线，以便后期实验 PDNPs 的准确定量
2.2.3 PDNPs 的 PEG-NH2 表面修饰
在圆底烧瓶中加入上述粒径最小的 PDNPs 溶液，用 Tris 调节反应液的 pH 至 10，分别按 dopamine:PEG-NH2的质量比 1:1、1:3 和 1:5 加入 PEG-NH2，继续反应 24 h，纯化得到三种表面修饰不同量 PEG-NH2的 PDNPs，分别标记为 PPNPs-1、PPNPs-2 和 PPNPs-3。
2.2.4 PDNPs 及 PPNPs 的表征和稳定性测试
2.2.4.1 形貌观察
将 10 µL 的 PDNPs-1、PDNPs-2、PDNPs-3 和 PPNPs-1、PPNPs-2、PPNPs-3 溶液分别滴加到铜网上，烘干铜网，使用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）仪器观察后进行尺寸大小的筛选。
2.2.4.2 红外光谱
将 PDNPs-1、PDNPs-2、PDNPs-3 和 PPNPs-1、PPNPs-2、PPNPs-3 溶液冻干后得到粉末。称取一定 量 的粉末用傅里叶 变 换红外光谱仪（ Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）对其表面的官能团进行分析，检测参数为：分辨率 0.5 cm-1，信噪比 40000：1，波数范围 4000-500 cm-1。
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第三章 PDNPs 复合衍生物的制备表征及 ROS 清除活性 ......................... 23
3.1 实验材料 ............................................. 23
3.1.1 实验试剂 ......................................... 23
3.1.2 实验仪器 ........................... 24
第四章 PLNPs 的体外和体内抗氧化研究 .................................... 33
4.1 实验材料 .............................................. 33
4.1.1 实验试剂 ....................................... 33
4.1.2 实验仪器 ............................................ 34
主要结论与展望 .................................... 47
主要结论 ........................................... 47
展望 ............................................. 47
第四章 PLNPs的体外和体内抗氧化研究
4.1 实验材料
4.1.1 实验试剂
本章所使用的实验试剂如表 4-1 所示。
药学论文参考
HEI-OC1 是小鼠耳蜗毛细胞，其被认为可用于筛选耳毒性药物的体外系统。在药物激活的凋亡途径、自噬、细胞保护机制、炎症反应和氧化应激等方面的研究中都已经被广泛应用[103-106]。BEAS-2B 细胞是正常人支气管上皮细胞。BEAS-2B 细胞具有对血清反应进行分化的能力，能够用于筛选诱导或影响分化及致癌的化学或生物制剂[107]。HEK293 细胞是衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，能够用于模拟人体肾脏模型[108]。实验动物是 ICR 雌性小鼠，4-8 周龄。
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主要结论与展望
主要结论
本论文以 PDNPs 为基础材料，设计并合成了三种不同粒径大小的 PDNPs 并筛选出了符合实验需求的尺寸大小，然后对筛选得到的 PDNPs 进行不同表面的修饰策略和筛选最佳的表面修饰策略，得到 PDNPs 衍生物 PLNPs。研究了 PLNPs 清除 ROS 的能力，并在细胞水平和动物水平上进行了功能验证。
（一）通过改变反应条件，控制反应温度和纯化方法可以得到超小尺寸的 PDNPs，以其为基础材料进行表面修饰和经过体内 PET 成像筛选得到能被肝脏肾脏代谢的合适材料 PLNPs。探究了 PLNPs 的溶液稳定性，发现其在 pH 5.0、pH 7.4、pH 10.0 的 PBS和 HD，LD，1640 培养基这些不同溶液介质中能够稳定存在 3 个月以上。同时还对 PLNPs的清除 ROS 能力进行了研究，发现其具有优异的清除 ROS 活性，能够清除 ABTS、DPPH、O2•−、•OH 和 H2O2 等自由基。
（二）使用 HEI-OC1、BEAS-2B 和 HEK293 三种不同的细胞对所得的粒子进行体外细胞水平实验探索，证明 PLNPs 在一定的浓度范围内对上述三种细胞没有明显的细胞毒性，并且对不同原因引起氧化损伤的细胞内 ROS 有一定的清除能力，从而达到保护细胞的效果，说明 PLNPs 具有优异的体外清除 ROS 能力。
（三）在动物实验水平论证了 PLNPs 的清除 ROS 的能力。实验结果表明 PLNPs 具有良好的生物体内相容性，并且能够有效缓解注射甘油引起横纹肌溶解而导致的 AKI模型病情的进展，说明 PLNPs 具有一定体内抗氧化能力，证明其在作为抗氧化的纳米材料方面具有巨大的应用潜力。
参考文献（略）