本文是一篇药学论文，笔者认为喜冬草在长白山地区资源非常丰富，通过本实验，丰富了喜冬草药材的化学成分，并一定程度上阐明了其抗肿瘤活性物质基础，但活性成分的构效关系及作用机制有待进一步深入研究。此研究为今后开发高效低毒的抗肿瘤新药提供了科学依据，同时也为合理利用长白山地区特色资源喜冬草奠定了理论基础。
第一章 绪论
1.1 化学成分
1.1.1 喜冬草属植物的化学成分
1.1.1.1 酚类
喜冬草属植物含有多种酚类化合物。1964 年，Inouye 等[14]从喜冬草中分离得到一种新的苯酚类化合物异高熊果苷（1）；1971 年，Walewska[18]研究发现伞形喜冬草中存在异高熊果苷（1）和熊果苷（2）等酚类化合物；2001 年，吕惠子等[19]从伞形喜冬草的乙醇提取物的乙酸乙酯部位分离得到肾叶鹿蹄草苷（3）和高熊果苷（4）。2015 年，Shin BK 等[20]从伞形喜冬草中叶和茎中分离出了一种新的萘酚 2,7-dimethyl-1, 4-dihydroxynaphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside（5）。其结构见图 1.1。
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1.2 药理作用
喜冬草属及鹿蹄草属植物具有多种药理作用，其中包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化等活性。
1.2.1 抗氧化作用
Galvan 等[11]用 DPPH（2, 2-二苯基-1-吡啶肼）含量测定的方法，验证了喜冬草及伞形喜冬草中提取物均具有抗氧化作用。同时经过实验进一步证明其抗氧化活性与植物中槲皮素和异槲皮素等类黄酮的存在有关；Galvan 等[11]推测梅笠草素也可能发挥抗氧化作用，因为其他醌类化合物，如铅花素和紫草素都具有较好的抗氧化活性；Yao 等[56]对鹿衔草的粗提取物进行了体外抗氧化活性测定，结果发现乙酸乙酯部位在 DPPH 法、ABTS 法以及β-胡萝卜素-亚油酸法测定中表现出较强的抗氧化活性[IC50（0.063 ± 0. 010），（0. 614 ± 0. 003），（0.027 ± 0.002）g·L-1]，还原能力与 BHT 及维生素 C 接近，认为该结果分布最高的主要原因是酚酸和黄酮类物质在乙酸乙酯部位广泛分布；Wang 等[57]采用 ABTS 和 FRAP 法测定了不同产区的鹿蹄草、普通鹿蹄草以及肾叶鹿蹄草 3 种植物的抗氧化活性，以及槲皮素、单宁酸和金丝桃苷 3 种内标物质的含量，结果表明鹿蹄草的抗氧化活性能力最强；Smirnova 等[58]在 DPPH 法及羟基自由基氧化损伤质粒 DNA 的修复测定中发现，圆叶鹿蹄草能够显著地影响过氧化氢酶活性基因 katG 的表达，起到良好的抗氧化作用。
1.2.2 抗肿瘤作用
Wan 等[12]发现梅笠草素具有良好的抗肿瘤作用，可以剂量依赖性地抑制成骨肉瘤细胞株的生长活性，同时降低该细胞对阿霉素的耐药性。Ma 等[59]发现梅笠草素能够剂量依赖性地抑制人乳腺癌细胞 MCF-7 的生长，并诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡；Cai 等[60]通过测定鹿蹄草总挥发油（PHVO）对软骨肉瘤细胞 SW1253 的生长抑制活性以及细胞周期调控蛋白的表达发现，PHVO 能够剂量依赖性地抑制该细胞的生长同时能够阻滞肿瘤细胞增殖。
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第二章 实验内容
2.1 喜冬草乙醇浸膏的萃取
将喜冬草药材乙醇浸膏用适量蒸馏水溶解，将混悬液置于分液漏斗中，加入等量石油醚，震荡，静置 6 h，得石油醚萃取液。重复萃取 5 次，合并萃取液。用旋转蒸发仪浓缩萃取液，得喜冬草石油醚萃取层浸膏约 53.5 g。如图 3.1 所示，而后依次加入乙酸乙酯，正丁醇试剂重复上述流程，依次得喜冬草乙酸乙酯，正丁醇，水层萃取物浸膏约 110.3 g，155.2 g，230.0 g。
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2.2喜冬草化学成分的分离
2.2.1喜冬草石油醚层化学成分的分离
取喜冬草全草醇提取的石油醚萃取层浸膏 50.2 g，用适量且适当比例的石油醚与乙酸乙酯溶剂溶解。加入 1.5 倍的正相硅胶，搅拌均匀。用旋转蒸发仪减压，浓缩至旋干。将样品硅胶拌样用研钵研细，干法上样。经正相硅胶（100 ~ 200 目）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（50:1–2:1）进行梯度洗脱，经 TLC 检测合并相同流分，得到 13 个流分 Fr. P1 ~ Fr. P13。
取流分 Fr. P3（2.8 g），干法上样，经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（80:1–0:100）进行梯度洗脱，TLC 检测合并后得 Fr. P3-1 ~ Fr. P3-6。其中流分 Fr. P3-3 经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，以石油醚-正己烷（40:1–0:100）梯度洗脱后，得到化合物 18（40.9 mg）。
取流分 Fr. P4（14.1 g），干法上样，经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（50:1–3:1）进行梯度洗脱，TLC 检测合并后得 Fr. P4-1 ~ Fr. P4-9。其中流分 Fr. P4-2 以二氯甲烷-甲醇（3:7）为流动相，用葡聚糖凝胶柱进行纯化得到化合物 1（28.6 mg）。
取流分 Fr. P5（3.2 g），干法上样，经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（40:1–2:1）进行梯度洗脱，TLC 检测合并后得 Fr. P5-1 ~ Fr. P5-4。其中流分 Fr. P5-2 经重结晶（甲醇）纯化得到化合物 9（18.8 mg）。流分 Fr. P5-3用正相硅胶（300 ~ 400 目）进行柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（20:1–0:100）进行洗脱，得到化合物 2（7.2 mg）。
取流分 Fr. P7（3.2 g），干法上样，经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，用石油醚-乙酸乙酯（20:1–2:1）进行梯度洗脱，TLC 检测合并后得 Fr. P7-1 ~ Fr. P7-7。其中流分 Fr. P7-2 经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（15:1–1:1）梯度洗脱后，以二氯甲烷-甲醇（3:7）为流动相，用葡聚糖凝胶柱进行纯化得到化合物 3（7.1 mg）。流分 Fr. P7-3 以二氯甲烷-甲醇（3:7）为流动相，用葡聚糖凝胶柱进行纯化得到化合物 19（5.7 mg）。流分 Fr. P7-5 经正相硅胶（200 ~ 300 目）柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（20:1–2:1）梯度洗脱后得到化合物 4（40.3 mg）和 16（28.7mg）。
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第三章 实验内容...............................16
3.1 喜冬草药材的处理............................. 16
3.2 喜冬草药材的提取.................................. 16
3.3 喜冬草乙醇浸膏的萃取.................................. 16
第四章 结果与讨论....................................22
4.1 化合物 1-25 的结构鉴定.............................22
4.1.1 化合物 1 的结构鉴定....................... 23
4.1.2 化合物 2 的结构鉴定........................... 25
第五章 结 论..................................79
第四章 结果与讨论
4.1 化合物 1-25 的结构鉴定
通过核磁共振以及旋光度等方式鉴定分离所得化合物的结构，如图 4.1 所示：
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结构解析：1H-NMR (300 MHz, CDCl3)谱显示：在δH 5.12 (1H, t, J = 3.5 Hz, H-12)处可见 1 个烯氢信号，说明有一个环内双键；δH 3.22 (1H, dd, J = 10.4, 5.2 Hz, H-3)处可见 1 个连氧次甲基氢信号；δH 1.07 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-28), 1.00 (3H, s,H-23), 0.95 (3H, s, H-26), 0.91 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-29), 0.80 (3H, s, H-24)和 0.79 (3H,s, H-25, 30)处可见 8 个甲基的氢信号，可推测为乌苏烷型三萜类化合物。
13C-NMR (75 MHz, CDCl3)谱中显示 30 个碳信号，在δC 139.7 (C-13)和 124.6(C-12)处可观察到 2 个烯烃碳信号；δC 79.2 (C-3)处可见 1 个连氧次甲基碳信号；同时在δC 28.3 (C-23, 28), 23.4 (C-27), 21.6 (C-30), 17.6 (C-29), 17.0 (C-26)和 15.8 (C-24,25)处可见 8 个甲基碳信号。
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第五章 结论
1. 本实验利用正相、反相硅胶柱层析法，葡聚糖凝胶柱层析法和重结晶等方法从喜冬草石油醚和正丁醇萃取物中分离得到了 25 个单体化合物，包括 9 个三萜类化合物，分别为α-amyrin（1）、uvaol（2）、triptohypol E（3）、ursolic acid（4）、2α, 3α, 23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid（5）、3-epi-corosolic acid（6）、corosolicacid（7）、asiatic acid（8）和 taraxerol（9）；6 个黄酮类化合物，分别为 quercetin（10）, quercetin-3-O-α-L-(5''-O-acetyl)-arabinofuranoside（11）、quercitrin（12）、kaempferol（13）、juglanin（14）和 kaempferol-3-O-α-L-5''-acetyl-arabinofuranoside（15）；2 个甾醇类化合物，分别为β-sitosterol（16）和 daucosterol（17）；2 个醌类化合物，分别为 chimaphilin（18）和 3, 4-dihydro-4-hydroxy-2, 7-dimethyl-naphthalen-1(2H) one （19）；1 个单糖类化合物 5-hydroxymethylfurfural（20）；1 个苯酚类 isohomoarbutin（21）；3 个 megastigmane glycosides 类化合物，分别为 (6S, 9S)-roseoside （ 22 ） 、 (6R, 9S)-9-hydroxymegastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside （ 23 ） 和 3β-hydroxy-7,8-dihydro-4-oxo-ionol-9-O-β-D-glucopyrano side（24）以及 1 个木质素类化合物koreanaside A（25）。化合物 11、15 和 23-25 为首次从杜鹃花科中分离得到；化合物 1-3、5-8、12、14、17、19、20 和 22 为首次从喜冬草属中分离得到；化合物 4、9、10、13 和 16 为首次从该植物中分离得到。实验结果说明萜类和黄酮类化合物喜冬草石油醚和正丁醇萃取层的主要化学成分。
2. 利用 MTT 法测定了从喜冬草石油醚和正丁醇萃取层中分离得到的 25 个单体化合物对 A549、HeL a 和 SK-Hep1 的抑制作用。实验结果表明，在 30 μM 的给药浓度下，化合物 2、7、16 和 18 能够抑制人肺癌细胞 A549 的生长，其抑制率分别为：60.33%、76.33%、56.33%和 76.67%；化合物 2、7、9、16、18 和 19 能够抑制人宫颈癌细胞 HeL a 的生长，其抑制率分别为：76.67%、76.67%、62.00%、59.67%和 62.67%；化合物 1、2、4、7、9 和 15~18 能够抑制人肝癌细胞 SK-Hep1 的生长，其抑制率分别为：56.00%、71.00%、58.33%、93.67%、72.67%、56.00%、68.67%、61.33%和 81.33%。综合以上实验结果发现，化合物 2、7、16 和 18 对这三种肿瘤细胞均具有一定的抑制作用。与阳性对照药阿霉素相比，化合物 7 和 18 在人肺癌细胞（A549）下具有与其较为相似的肿瘤细胞毒活性，其 IC50 值分别为 5.21 ± 1.42和 1.25 ± 1.14 μM；化合物 7、16 和 18 在人宫颈癌细胞（HeL a）下具有与其较为相似的肿瘤细胞毒活性，其 IC50值分别为 6.19 ± 1.51，1.96 ± 0.22 和 1.21 ± 0.47 μM；化合物 16 和 18 在人肝癌细胞（SK-Hep1）下具有与其较为相似的肿瘤细胞毒活性，其 IC50 值分别为 1.52 ± 0.32 和 2.56 ± 0.63 μM。本研究结果可推测喜冬草的三萜类、甾醇类和醌类为主要肿瘤细胞毒活性成分。
参考文献（略）