本文是一篇药学论文，本论文主要综述了曲霉属真菌的应用研究和次级代谢产物的结构及生物活性研究进展，曲霉属真菌能够产生具有活性多样和结构新颖的化合物，大部分的化合物显示出具有一定的细胞毒活性、抗菌活性、抗感染活性和抗病毒活性，对天然产物的研究具有一定的意义和价值。
第一章 绪论
1.1 引言
曲霉（Trichocomaceae）是一种丝状子囊菌，曲霉属菌种近年来一直是人们重点研究的对象，因为它们可以产生大量具有特殊活性的代谢产物。
目前，在工业生产上曲霉菌在很多方面得到了广泛的应用，如在食品发酵方面，可以用来酿造酱油、清酒和白醋等，在农业生产方面，曲霉可以用来降解有机磷农药和糖化饲料等。同时，曲霉菌也是造成农产品质量下降的主要原因，曲霉可以在食品和饲料生产前或生产后的不同阶段污染食品[1]。因此，曲霉属真菌对于人类的作用具有两面性，一方面，部分曲霉属菌种会侵害人体的呼吸器官，给家禽、家畜等造成危害，在畜牧业的发展上造成了一定的影响；另一方面，部分曲霉属菌种可用于生产衣康酸，如土曲霉，可用于生产降解蛋白质的蛋白酶、柠檬酸等的黑曲霉，以及生产曲酸的黄曲霉等。
曲霉属真菌为了适应它们所生存的复杂的生态环境，产生了大量次级代谢产物，比如目前已经被人类应用的由土曲霉产生的医药化合物洛伐他汀，它是有效降解胆固醇的药物之一。许多曲霉属的次级代谢产物具有细胞毒活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗感染活性和抗真菌剂活性。
本文对近几年来曲霉属真菌的研究概况、次级代谢产物和生物活性方面的研究进展进行了综述，期望能为曲霉属真菌的应用提供参考。
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1.2 曲霉属真菌研究概况
1.2.1 曲霉属真菌的生物多样性
曲霉属（Aspergillus）作为地球上普遍存在的真菌群之一，大概由 300 多种菌种组成，分布在各个亚属[2]，它们的生活方式复杂多样，曲霉属菌的繁殖方式大部分都是通过在特征性分生孢子头上分支的分生孢子进行无性繁殖，少数物种表现出自体受精或者是专性异性杂交进行有性繁殖[3]，在一些个别物种中也发现了变性循环，曲霉属的 性阶段之 前被列分别为不同 的外形，例如 Eurotium, Neosartorya 或Emericella。
1.2.2 曲霉属真菌对人类的影响
曲菌属为曲霉目中的一种，广泛分布于大自然中，同时也是使各种物质霉腐的主要真菌（面包的腐败变质和煤物质分解等），其中以黄曲霉毒性尤为明显，影响也较大。但是，一些曲霉菌却有着较强的酶活力，例如绿色曲菌与黑曲霉等，在传统食品发酵业中应用很普遍（制酱、酿酒等），在现代发酵产业中也发挥了很大的作用，因此可用来制造葡萄糖氧化酶、糖化酶、蛋白酶以及酶药物等。以米曲霉为首的霉菌，基本都与酒、酱油等的酿制有着密不可分的关系。但是，这些真菌同时又存在着两面性，一方面主要是指能够用来生产一些有益化学物质的真菌，例如蛋白质消化剂中的蛋白酶等，另一方面，很多真菌影响禽类、牲畜乃至人类的呼吸器官，例如由烟曲霉所致曲霉症[4]。
黄曲霉毒素会在人和动物中引起真菌病，即由真菌感染引起的疾病。黄曲霉是一种能够引起动物和植物获病的致病菌，这是黄曲霉作为常见侵袭性曲霉病源的原因，大概占人类所有感染病的 20％左右；主要是 Aspergillus fumigatus 感染，基本占侵袭性曲霉感染的 90％左右[5]。在炎热干燥的地区，黄曲霉会引起大多数真菌性鼻炎，皮肤感染和角膜炎等，例如在非洲和中东等地区[6]。同时对黄曲霉感染的曲霉菌病敏感度较高的动物还包括兔子，鸡等。
黄曲霉容易定殖在富含油的农作物（包括玉米，花生和棉籽）收获前或者收获后的种子中，并产生黄曲霉毒素，例如黄曲霉毒素 B1（致癌性较强）。由于黄曲霉毒素具有较强的致癌性和毒性，因此控制好农作物里的黄曲霉毒素污染非常重要。但是，在农作物收获前或者收获后控制黄曲霉毒素污染需要花费大量的财力，比如在美国，每年为控制黄曲霉毒素污染会大约花费 10 亿美元，在很多非洲国家每年也会大约消耗 6 亿多美元去控制毒素污染[7]。为了进一步控制黄曲霉毒素，美国食品和药物管理局采取了相应措施，只允许生产含微量黄曲霉毒素的食品和黄曲霉毒素的牛奶，而欧洲的一些国家甚至采取来了更为严格的标准。然而对于黄曲霉毒素污染的控制，在大多数发展中国家做的还不够严格。
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第二章 黄曲霉次生代谢产物研究
2.1 引言
曲霉属中很多菌种是土壤和大气微生物系统的必要组成部分，对于自然界的物质的分解过程有重要的作用，具有一定的经济价值和研究意义。曲霉属中很多菌种无论是在传统发酵业还是现代发酵业，以及许多的生物工程中，都发挥着重要的作用。研究发现，在曲霉属的菌种中存在着各种各样丰富的酶，例如过氧化氢酶，蛋白酶和乳糖酶等，因为具有多种催化特性，使得它们在工业生产和生物转化方面有明显的作用[36]。例如在很多有机化合物进行转化时可以利用曲霉真菌的细胞或者孢子通过氧化、还原和酯化等产生作用，总之曲霉与人类的关系是密不可分的。
黄曲霉是一种具有黄绿色外观且常见的真菌，在干燥和炎热的气候中，越干旱的热带地区，种群的数量越多。由于昆虫和线虫病毒感染会损坏了植物对真菌入侵的自我防御，被病毒感染了的植物的生长和产量都会受到影响，进而导致真菌继续生长，最终在干燥的谷物中形成了毒素[37]。
全世界每年大约有 125 万人死于肝癌其中大约 50％发生在我国，我国是世界上肝癌的高发区。目前，外科手术切除仍是肝癌防治和治疗的主要手段，但临床上肝癌的手术切除率只有 15%～20%，手术治疗后复发率高达 60%～70%以上[38]。黄曲霉次生代谢产物丰富，许多次级代谢产物具有细胞毒活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗感染活性和抗真菌活性。
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2.2 实验材料与方法
2.2.1 仪器与试剂
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2.2.2 菌种来源及其鉴定
黄曲霉（Aspergillus flavus）真菌，提取分离自甘肃省武威市民勤县的一种碱性土壤内，经过 18S rR NA 菌种鉴定，鉴定为曲霉属真菌黄曲霉。菌种现保存于在兰州大学天然有机实验室内。
2.2.3 培养基的配方
PDA 培养基：把 200 g 土豆去皮后切成小块，加热煮沸 30 min 后过滤，取葡萄糖 20 g，加琼脂 20 g 和 1 L 蒸馏水，摇匀。
PDB 培养基：用去皮土豆 200 g 切成小块，加热煮沸 30 min 后过滤，取葡萄糖20 g，加 1 L 蒸馏水，摇匀。
大米培养基：把 80 g 大米加入 1000 mL 的锥形瓶中，再加 120 mL 水，静置 10min，然后在 121 ℃下高温灭菌 30 min。
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第三章 部分化合物 HepG2 细胞毒活性研究........................35
3.1 引言................................... 35
3.2 实验材料与方法.................................. 35
3.2.1 仪器与试剂.....................................35
3.2.2 实验方法............................35
总结.............................39
第三章 部分化合物 HepG2 细胞毒活性研究
3.1 引言
肿瘤是由许多因素联合引起的，是以异常的细胞结构或组织不受控制地扩大和蔓延为特点的病症，致死率仅次于心血管疾病[54]。现今，大约有百分之六十的抗肿瘤药剂以及百分之七十五的抗传染病药剂来源于天然产物，而多达三十种来源于天然产物的化合物已经被广泛用作对所有不同阶段肿瘤的临床诊断研究[55]。随着化学预防与治疗肿瘤科学技术的不断进步，研制与改进新型的化学防治与化疗药品已成趋势。天然产物，由于其含有多种多样的化学结构和生物学活性的抗癌因子，在药物开发过程中起到了很大的作用。由于工艺技术与方法学研究的不断深入，许多新型的天然抗肿瘤药品及衍生物已几经严格筛选，并广泛应用于临床诊断中。
全世界每年大约有 125 万人死于肝癌其中有大约 50％发生在我国我国是世界上肝癌的高发区。目前，外科手术切除仍是肝癌防治和治疗的主要手段，但临床上肝癌的手术切除率只有 15%～20%，手术治疗后复发率高达 60%～70%以上[56]。曲霉属真菌次生代谢产物丰富，许多次级代谢产物具有细胞毒活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗感染活性和抗真菌活性。因此我们想通过对黄曲霉次级代谢产物的研究，寻找结构新颖并对肿瘤细胞有抑制活性的化合物。
本论文采用 MTT 法对分离得到的含量较大的化合物 1、3、4、8、9、10 进行了人肝癌细胞 HepG2 细胞的细胞毒活性测定，在样品浓度为 100 μg/mL 和 200 μg/mL时，样品药物处理时间为 24h，化合物 9 表现出良好的细胞毒活性，其 IC50 为18.7μg/mL；阳性对照品盐酸表柔比星的 IC50为 0.38 μg/mL。其他化合物均未表现出明显的细胞毒活性。
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总结
为了寻找生物活性良好和结构新颖的化合物，本论文以提取分离自甘肃省武威市民勤县一种碱性土壤内的曲霉属真菌黄曲霉为研究对象，对其大米培养基次级代谢产物进行了系统的化学成分和部分生物活性研究。
采用葡聚糖凝胶柱层析、反相C-18柱层析、MCI凝胶柱层析、硅胶柱层析等实验室分离技术对黄曲霉大米培养基的次级代谢产物进行分离和纯化，利用1H NMR、13C NMR、NOE、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等现代波谱技术，并通过查阅相关文献进行对照，鉴定出18个化合物的结构，其中包括聚酮类、酯类、醌类和生物碱类化合物，其结构分别为：methyl radiclonate(1), 1,7-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-8-methoxydibenzo[b,e]oxepine9,10-dione(2), 6,8,1'-tri-O-methylaverantin(3), methyl-aver antin(4), 8-O-methylaverythin(5), 6,8-O-methylaverantin(6), notoamidesC(7), fischex anthone(8), AGI-B4(9), averantin(10), 1-羟基-3-(羟甲基)-8-甲氧基二苯丙[b,e]氧杂卓9,10-二酮(11), 3-hydroxy-5-methybenzonicacid(12), 6-methylbenzene-1, 2, 4-triol(13), 7,9-dihydroxy-3-methoxy-1-methyl-6h-dibenzo[b,d]pyran-6-one(14),(E)-5-(hydroxyniethyl)-2-(6'-methy1hept-2-en-2'-yl)pheno(15), diorcinol(16), 4-羟基苯乙酸甲酯(17), 4- methoxybenzylmehano(18), 其中化合物1为新化合物，化合物2、3、4、5、6是首次从该菌种中分离得到的。采用MTT法对分离得到的量较大的化合物1、3、4、8、9、10进行了人肝癌细胞HepG2细胞的细胞毒活性测定，化合物9表现出较好的细胞毒活性，其IC50为18.7 μg/mL ；阳性对照品盐酸表柔比星的IC50为0.38 μg/mL。其他化合物均未表现出明显的细胞毒活性。
本论文主要综述了曲霉属真菌的应用研究和次级代谢产物的结构及生物活性研究进展，曲霉属真菌能够产生具有活性多样和结构新颖的化合物，大部分的化合物显示出具有一定的细胞毒活性、抗菌活性、抗感染活性和抗病毒活性，对天然产物的研究具有一定的意义和价值。随着分离分析技术的发展，曲霉真菌已经成为新药研发的重要来源，具有较好的发展前景。本论文的研究成果希望能丰富天然产物的数据库，为该属真菌资源的开发利用提供支持，为天然产物资源的开发利用做出贡献。
参考文献（略）