第1 章 绪论
1.1 引言
现阶段癌症已经成为威胁人类尤其是我国人民健康的最大问题之一。而目前我国治疗恶性肿瘤的方法还主要集中在手术治疗、化疗和放疗上。手术治疗的创伤性大，对于身体的某些部位以及某些类型的癌症而言，手术难度及风险性极大，而且对于一些亚临床转移灶是无效的，难以达到治疗目的。而化疗药物在人体内的靶向性差，呈非特异性分布，不可避免地伤及正常组织和细胞，而且化疗对于病人的全身状况要求较高，全身状态差者难以接受化疗。放疗仅对部分肿瘤敏感，而且能够杀伤肿瘤细胞的放疗剂量，往往对于正常组织的损伤也相当大，出现较多的不良反应。很多恶性肿瘤往往起病隐匿，待病人发现时已进入终末期，而至今又没有一个完善的能够早期无创性的癌症监测手段。上述在诊断和治疗方面的缺陷，自然而然地使科研人员及临床医务工作者着力去开发新的诊疗技术，并且此种理想的诊疗技术应具备如下倾向：早期诊断敏感性、治疗上具有微创性、高效性及靶向性。
近年来，随着纳米技术的迅猛发展，其在生物医学领域中的巨大的应用潜力已逐渐显现出来，人们试图利用纳米技术来寻求诊治恶性肿瘤的突破口。在众多的被研究的纳米材料中，稀土上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）因其自身所特有的优势，已引起了科研工作者的广泛关注。现阶段，科研人员已经在多个生物医学领域，如生物成像、生物传感、光动力学治疗（photodynamic therapy，PDT）、光热治疗（photothermal therapy，PTT）、药物输送等方面开展了广泛深入的研究。UCNPs 所具备的较高的化学稳定性、低毒性、不易光解和光漂白、较大的组织穿透深度、避免组织自发荧光，以及对生物组织的损伤小等一系列特异性优势，更是使其在对于机体恶性肿瘤的微创性、靶向性诊疗方面，有着不可估量的广阔应用前景。
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1.2 上转换纳米粒子简介
1.2.1 上转换纳米粒子的生物材料概述
纳米技术是指在纳米尺度（1-100nm）上利用和操控物质的方法。它能够改善、增殖和提升已有的传统技术，故又被称之为“使能技术”[2]，也就是使不可能实现的变得可能。被加工到了纳米尺度的物质会出现一系列特殊的理化性质，如材料的光、电、磁、力学等性能都发生显著的变化,具有这种特殊性能的材料称之为纳米材料，它的特性表现为四大效应，即表面效应，小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应[3，4]。纳米材料因其卓越的性能，目前不仅广泛应用于工业方面,在生物医疗领域也表现出了巨大的应用价值[5-8]。随着纳米生物学与生命科学相结合，人们已逐渐意识到，纳米技术必将在医学事业的发展中开辟一个新的里程碑。
上转换发光是相对于下转换发光而言的，多数发光材料都遵循下转换发光，也就是斯托克斯（Stokes）定律——发射光谱位于比激发光谱低的能量区，或者说发射光波长大于激发光波长。Auzcl 在 1966 年研究 Er3+掺杂的 NaY（WO4）2玻璃时，出乎意料地发现了另外一种发光现象，这种发光完全违背斯托克斯定律,以低能量的光子激发，得到高能量的光子。这种荧光现象称之为反 Stokes 发光或上转换发光[9,10]。多数上转换发光材料都含有镧系元素（稀土离子）,如含硫化合物、氟氧化物、氟化物、卤化物等[11]。UCNPs 由基质材料和稀土离子掺杂剂（敏化剂和激活剂）组成。基质是主体, 它不构成发光能级，但是能够为激活剂提供合适的晶体场[12-14], 激活剂是构成发光中心的离子，可以吸收敏化剂传递的能量。敏化剂是能够吸收激发光子的能量并传递给激活剂的离子。上转换发光效率最高的基质材料是 NaYF4，特别是对于掺杂 Yb3+-Er3+、Yb3+-Tm3+的体系而言[15-17]。UCNPs 可以被近红外光激发，发出可见光，这一特性使其在生物医学领域的应用当中，具备了其他发光材料所无法比拟的优势：对生物组织的穿透力深且对组织的损伤小、可以显著降低背景荧光、提高信噪比和灵敏度。同时 UCNPs还有化学稳定性强、对绝大多数细胞无毒性[18,19]、最大发射波长可调节[20,21]、光学性质稳定、荧光寿命长、发射峰窄等优点。上述特点使得 UCNPs 在生物医学领域发展中，具备了广阔的发展空间。
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第2章 上转换纳米粒子的制备及其表面配体和电荷依赖的细胞富集性与毒性研究
2.1 引言
稀土上转换纳米粒子（UCNPs）具有化学稳定性高、光稳定性强、荧光寿命长、生物毒性小的特性；并且以近红外光作为激发光源，具有较强的组织穿透力、无生物背景荧光干扰以及对生物组织几乎无损伤等显著优势。而上述 UCNPs 的这些优势，恰恰符合一个理想的生物成像标记物所应具备的特点。然而，UCNPs在生物医学领域中，尤其在生物成像中应用的前提条件就是——纳米材料粒径小且分布均匀，发光效率高、生物兼容性好。这就要求我们在制备纳米粒子时，必须要兼顾以上条件，才有可能使其在生物医学领域乃至在临床应用中进一步发挥作用。高温热分解法制备出的 UCNPs，颗粒分布均匀，形貌可控，发光效率高。在本章中，我们即采用此法制备 UCNPs。但是高温热分解法合成的纳米粒子，其表面配体是脂溶性的长链烷烃（如油酸、油胺等），在水或者生理缓冲液中难以分散，不能直接应用到生物体系中去。现阶段，已形成了多种对于 UCNPs 的表面修饰方法，以实现纳米粒子从油相到水相的转变。这些方法包括：配体交换法、聚合物包覆以及二氧化硅包覆等。而在对纳米粒子进行表面修饰的过程中，同样需要兼顾前述的条件——材料的粒径、分布、发光效率以及生物相容性。聚合物包覆法和二氧化硅包覆法会导致 UCNPs 的粒径增加，而配体交换法修饰的UCNPs 在尺寸上的变化不明显。因此本研究中我们选择了配体交换法对NaYF4:Yb3+,Er3+上转换纳米粒子进行表面修饰，进而实现上转换纳米粒子的相转移。
自 20 世纪 90 年代初，纳米粒子因其具有其独特的物理，化学和生物特性，已经在生物医学应用领域如分子成像[106]，药物转运[107]以及组织工程[108]等方面引起了广泛的关注。特别是镧系离子（稀土离子）掺杂的上转换纳米颗粒（UCNPs），因其具有独特的近红外光激发的光学特性，在细胞和动物荧光成像中提高组织成像深度，结合荧光成像（FI），磁共振成像（MRI）和正电子发射横向断层多模成像（PET）等方面均引起了巨大的关注[109]。同时 UCNPs 还因其具有巨大的比表面积，不仅在分子成像中，而且在作为光动力疗法（PDT），基因治疗[110,111]和化学治疗[112]的载体方面，也都存在着巨大的应用潜力。UCNPs的高化学稳定性，还为其在未来体内生物医学的广泛应用提供了先决条件。因为分子成像，药物递送和细胞内基因递送取决于纳米颗粒的细胞吸收效率，了解上转换纳米颗粒与细胞的相互作用就成为一个关键问题[113]。
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2.2 实验材料
2.2.1 主要试剂
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第 3 章 诊疗一体化上转换纳米平台的构建及其表征........... 29
3.1 引言...................................................29
3.2 实验材料.............................................. 32
第 4 章 上转换纳米平台的肿瘤诊疗效果与生物安全性研究..........41
4.1 引言..................................................41
4.2 实验材料.............................................. 41
第 5 章 总结与展望.......................................53
5.1 论文总结............................................... 53
5.2 研究展望................................................ 55
第4章 上转换纳米平台的肿瘤诊疗效果与生物安全性研究
4.1 引言
相对于传统的肿瘤治疗手段而言，光动力治疗（PDT）具有微创性、靶向性、低毒性、可重复性、可协同性以及成本相对低等巨大优势。与光动力治疗相对应的概念是光动力学诊断(photodynamic diagnosis,PDD)，指的是利用特定波长的光照射激发光敏分子，产生一定的可以用来进行成像的荧光发射信号。PDT治疗过程中光敏剂的吸收带为可见光和紫外光；而在PDD中，为了获得高对比度的成像，往往需要组织穿透力较强的近红外光。上述二者的矛盾导致了在单一激发波长下，难以实现诊断和治疗一体化。在上一章中，我们构建了UCUPs (Yb, Er, Tm)-C60MA上转换纳米平台，通过分析其性质表征了解到，由于UCNPs上转换纳米粒子到C60MA光敏剂分子之间选择性的能量传递，我们成功的实现了PDT和PDD二者有机的结合。
在本章中，我们将应用NCUPs (Yb, Er, Tm)- C60MA上转换纳米平台，在细胞水平考察其靶向成像及光动力杀伤的功效。还将进一步把纳米光敏平台具体应用到荷瘤小鼠的成像及光动力治疗中去，进而从宏观的临床应用角度来研究我们所构建的纳米平台在诊断和治疗方面的实用价值。同时，由于生物安全性是临床应用的前提条件和基本保障，因此我们还将重点研究单一波长激发下，高对比度成像引导的光动力治疗对于生物体的安全性问题。
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4.2 实验材料
细胞培养、共焦成像以及表征所涉及的主要试剂和仪器，与上文相同者在此不再赘述，详见第3章。小鼠采血及血液分析相关实验设备及操作步骤，由吉林省长春市儿童医院蔡玉本老师、王彦老师提供并协助完成；小鼠活体成像、组织病理切片相关实验设备及操作，由中科院长春光机所孔祥贵老师、刘晓敏老师提供并协助完成。以上实验材料及实验步骤在此不逐一列出。
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第 5 章 总结与展望
5.1 论文总结
随着生物医学研究的不断深入发展，人类对于恶性肿瘤的早期诊断和成功治疗的期望值越来越高。然而，恶性肿瘤往往起病隐匿，发展迅速，待到临床症状出现时已达到癌症终末期。并且在恶性肿瘤的诊断和治疗上，能够早期准确的检测肿瘤并安全、高效且无创性的治疗肿瘤的医疗手段少之又少。针对以上诊断和治疗方面的缺陷，越来越多的科研人员着手于开发一种能够早期敏感诊断，并能够微创、高效地治疗恶性肿瘤的诊疗技术。
稀土掺杂上转换纳米粒子(UCNPs) 受到低能量的光激发，可以发出高能量的光。它所具备的诸多优势——对生物组织的穿透力深且对组织的损伤小、可以显著降低背景荧光、较高的灵敏度、化学稳定性强、对生物体系毒性低、最大发射波长可调节、光学性质稳定、荧光寿命长、发射峰窄等特点——引起了生物医学研究人员的巨大关注。本论文中，我们应用高温热分解法制备出了分散性良好、粒径分布均一、结晶性好、发光效率高的稀土上转换纳米粒子，并应用配体交换法实现了UCNPs从油相到水相的转变。以共价偶联对UCNPs进行了功能化修饰，进而构建了具有诊疗一体化功能的上转换纳米平台，并进一步对于恶性肿瘤在体内靶向成像以及光动力学治疗的应用中，研究了其诊疗效果及生物安全性问题。取得了以下研究结果:
(1)制备了可应用于生物医学研究的上转换纳米粒子：能够应用于生物研究乃至进一步发展到临床医学应用中的前提条件是——纳米粒子在粒径、分布、发光效率以及生物相容性等方面需具备良好的性质。高温热分解法制备的NaYF4:Yb3+,Er3+纳米粒子，具有分散性良好、结晶性好、粒径分布均一、发光效率高等特性；并采用配体交换法，用氨基磷酸，聚丙烯酸以及聚丙烯胺等不同配体，对纳米粒子进行了表面修饰，从而成功地实现了纳米粒子从油相到水相的转变，为下一步的研究工作提供了先决条件。
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参考文献（略）