前言
中枢神经系统内最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤是神经胶质瘤，这一点已经得到了公认，脑胶质瘤在我国占居颜内肿瘤发病率的首位。脑胶质瘤病理类型包括少突胶质细胞瘤、星形胶质细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、室管膜瘤以及髓母细胞瘤等，其中以多形性胶质细胞瘤多见，发病部位于大脑半球多见。但直到目前，该病的预后仍十分不理想，即使经开领手术切除病灶+后期联合化疗或放疗，胶质瘤的复发率仍高，其平均生存期只有14个月，而其中恶性脑胶质母细胞瘤的中位生存期则不到1年。脑胶质瘤一直是研究的难点及热点。目前认为可能的诱发因素包括遗传因素、生物因素、环境因素、物理因素、化学因素等多种因素作用。临床上以病理组织学检验结果对胶质瘤进行诊断并分级。但是单纯依靠组织形态学进行诊断并分级存在一定脾端，尤其是根据立体定.向进行病理取材的标本通常较小，有时所取材组织可能缺乏典型的病理改变，常常不能根据其病理变化准确判断病情，为诊断、治疗和预后带来诸多困难。胶质瘤的病因、发展、临床表现复杂，相应胶质瘤的治疗方法也呈现多样化，传统临床治疗方案主要是以手术为主，目前已从既往的单纯手术切除原发病灶演变为当今根据患者病情、身体状况给予手术并相应辅助放疗和化疗或放化疗联合的综合化、个体化治疗：以手术切除治疗为主，包括手术、放疗、化疗、基因治疗、中医药治疗、免疫治疗、心理治疗等多个治疗方案的综合应用]。但仍旧可能存在胶质瘤残瘤余留，继而持续增殖，最终导致胶质瘤复发，患者生存期短预后差。其中胶质瘤难以根治性治疗的关键是其侵袭性生长方式。目前现有各种胶质瘤治疗方法，仍无法达到彻底治愈，并且对正常组织存在可能的毒副作用，对机体造成较大损害，不仅胶质瘤确诊治疗后五年生存率并未显著提高，且严重影响患者生存质量，因此导致手术后复发率高，成为患者死亡的主要原因。因此寻求能够有效治疗胶质瘤，并抑制胶质瘤侵袭复发特性的发生成为医学界攻关难题。随着生物靶向治疗手段越来越受到重视，目前更侧重于胶质瘤的分子紀向治疗，但是目前分子治疗机制尚不完全清楚。
microRNA,又可被称为miR、小分子RNA或微小RNA，一般由19- 25个核苦酸组成，长度在18-22nt左右，是非编码蛋白质的小分子短链RNA，己证实其具有调控功能，且广泛存在于真核生物中保持高度的组织特异性、时序性和19保守性，暗示其在生命活动中具有必不可少的调节作用，对基因表达、生长发育和行为等都具有广泛和深远的效应。miR在线虫中于上世纪90年代首先发现，即lin-4，其功能是可以调控线虫时序发育，其后在水稻、病毒、线虫、果姆、小鼠以及人类中相继发现，目前数目已超过4500种[14，15]。前体微小RNA由Drosha酶切割成发夹状前体，约70nt左右，由RNA聚合酶II转录产生，pre-miR是miR的前身，转运至细胞质，由RNA酶in内切酶家族的Dicer酶剪切前体微小RNA形成，从各自的pre-RNA的5’端释放出來，成为18-22 nt的成熟的双链miR，通过与紀基因的3' - UTR区域结合从而调节祀基因的表达。当其与3' - UTR完全互补结合时，能降解祀基因，导致解靶基因无法进行转录与翻译；当其与3' - UTR不完全互补结合时，则通过抑制基因的翻译来实现对靶基因表达的调控，通过此方式发挥对祀mRNA降解或阻遏其转录后翻译旳作用。
高度保守的基因调节因子miRs的出现对胶质瘤的诊断、治疗提供了新的思路和方向。miRs作为肿瘤生物标记物，其具有组织敏感性，通过以促进肿瘤生长的癌基因方式或抑制潜在恶性细胞生长的抑癌基因方式发挥作用，影响着生物体的发育、分化、增殖、调亡、免疫调控等生理活动，以及对恶性肿瘤的发生进行精确调控。由于miRs的表达特点的变化可以被及早发现，因此其可以用于癌症的早期检查。目前miRs与胶质瘤的相关研究尚存在较多空白。在前期研究中，部分miR在胶质瘤中参与胶质瘤细胞的增殖与侵袭转移且表达异常，这已经得到证实。现已证实一部分miR在胶质瘤中表达明显上调，可以促进胶质瘤侵袭，包括iniR-21，miR-221/222, miR-lO-b等；另外一方面，已证实部分miR 可以抑制胶质瘤侵袭，包括 miR-146b, miR -199b, miR -451, miR -181a,miR-128，miR-181c，miR-181b等。对胶质瘤标本和胶质瘤细胞系应用RT-PCR方法检测，已证实miR-lOb可促进胶质瘤细胞的侵袭，其表达上调。此外，miR-10b可以调节uPAR(尿激酶型纤溶酶原激活剂受体urokinase-typeplasminogen activator uPAR)和RhoC (Ras同源性原癌基因C)表达，促进胶质瘤的侵袭、转移。miR-21可促进胶质瘤细胞侵袭，其机制是通过调控金属蛋白酶组织抑制因子3 (TIMP3)基因及抑癌基因RECK，下调MMPs(基质金属蛋白酶家族，matrix nietalloproteinases，MMPs)抑制剂表达。此外，miR-221/222 促进胶质瘤侵袭是通过激活AKT (磷酸蛋白激酶B)信号通路完成。miR-128，miR -199b, miR -146b, miR -451, miR -181b, miR -181c, miR -181a 等 miR抑制胶质瘤侵袭，在胶质瘤中表达下调。miR-M6b-5p抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的翻译，通过下调 EGFR 的表达来抑制胶质瘤细胞的侵袭。miR-184与肿瘤的发生、发展关系密切，研究证实，miR-184在肝癌，胃癌，舌憐癌，神经母细胞中参与调节细胞增殖，细胞调亡和细胞迁移转移等重要功能，并与患者愈后有密切的相关性，然而miR-184在胶质瘤中的研究尚未见报道，对其分子机制研究尚不清楚。
第一部分MiR-184的表达与神经胶质瘤不同病理级别的关系
1.1实验材料
1.1实验材料
1.1.1主要仪器和材料
超纯水仪美国MILLIPORE公司
微量加样枪美国RAININ公司
电子天平日本岛津公司
pH计日本岛津公司
分析天平瑞士 Mettler-Toledo
4658型磁力掠拌器德国Cole-parmer
CS-501恒温水浴箱中国重庆实验设备厂
-80°C低温冰箱德国Bechman
超声细胞破碎仪VIRSONIC 100
1.2方法
1.2.1研究对象选取
选取2011年9月至2012年12月期间20例经病理组织学检查确诊为胶质瘤的入住山东大学齐鲁医院及山东省聊城市人民医院神经外科的患者的临床资料，所有入选患者经手术治疗，其中男性12例，女性8例，年龄26-58岁，平均年龄（35.2±5.6)岁，在术中取材。选取在山东省聊城市人民医院神经外科因脑外伤行减压术后的正常脑组织标本的10例患者作为对照组，其中男性6例，女性4例，年龄24-61岁，平均年龄（36.5±7.8)岁。纳入标准：所有患者均为首次发现胶质瘤，首次接受手术治疗，术前未接受化疗、放疗等其他方式治疗，所有入选的研究对象均签若知情同意书。排除标准：属于复发性胶质瘤；既往接受手术治疗；既往接受过放疗或化疗治疗；入院时合并其他疾病，如感染性疾病、恶性肿瘤、严重糖尿病、严重肝肾疾病、肺纤维化、骨代谢性疾病、全身免疫性疾病以及恶性肿瘤并发症等；患者年龄小于20岁或大于66岁。对入选患者的所有相关临床资料进行记录，包括性别、年龄、身高、体重、家族史等一般资料，以及其他疾病、服药史、家族史等。在患者手术前进行常规超声心动图检查，以及心电图、胸部X片等检查。入选研究对象均告知并签署知情同意书，研究内容经医院伦理委员会批准。
1.2.2患者胶质瘤取材和分级
胶质瘤术中取材标本和正常脑组织取材后，无菌条件下，分成若干小块，置于冻存管中，迅速放入液氮中保存。对胶质瘤组织送病理科进项鉴定，按WHO神经系统肿瘤分类病理标准分级，其中5例属于I级脑胶质瘤，均为毛细胞型星形细胞瘤；4例属于II级脑胶质瘤，分别为原架型星形细胞瘤1例、室管膜瘤2例、弥漫性星形细胞瘤1例；8例属于III级脑胶质瘤，分别为少突胶质瘤2例、中枢神经细胞瘤2例、间变性细胞瘤1例、间变性星形细胞瘤2例、间变性室管膜瘤1例；3例属于IV级级脑胶质瘤，分别为胶质母细胞瘤2例，髓母细胞瘤1例。根据WHO神经系统肿瘤分类病理标准，低恶性度胶质瘤是I-II级；而m-iv级属于高恶性度组。
每个样本检测3个复孔。不含RNA模板的ddH20在经过DEPC处理后作为阴性对照。将血清miIl-497的念量归一化为血清体积，来作为内参照，即以相同体积作为标准进行样本含量的测定比较，并釆用绝对定量法测定，分别稀释成浓度梯度作为标准品，X轴为浓度的对数(loglO)，Y轴为每个浓度对应的Ct值。每个浓度梯度设3个孔，并重复3次测定。将标准品与待测样本同时进行PCR扩增，根据扩增曲线在扩增结束后设定统一的阈值，绘制标准曲线，该样本的绝对含量根据标准曲线及待测样本的Ct值计算出。
恪解曲线原理：根据SYBRGreenI染料只和双链DNA结合的这一特性，设计一个逐渐升温的过程，随着温度的升高，从55°C到95°C，双链DNA不断的解链，随着双链DNA的变性，突光染料又回复到游离状态，这会导致荧光信号降低。因为SYBRGreenI染料只和双链DNA结合，SYBRGreenI染料的结合数量也在减少，发出的焚光也越来越少，当到达产物Tm值的时候，突光信号会突然下降，然后趋于平缓，这时表明双链完全解开，不发突光。用温度与荣光信号改变的负的一次导数作图，在软件的反应设置面板增加焰链温度检测模块，就可以在反应结束后，点击培解曲线按钮，从而获得该样品反应的培解曲线。在结果的分析中，单一的培解峰对于获得高质量实验结果是非常重要的。做溶解曲线是为了观察我们扩增发出突光的片段是不是我们需要的产物。如果溶解曲线做出来只有单峰，且出锋位置就是你的退火温度，那么这个焚光是你的产物发出的，证明实验结果有效。
第二部分MiR-184对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭的调控
2.1实验材料..............................34
2.2方法..............................39
2.3结果..............................43
2.4讨论..............................45
2.5结论..............................48
第三部分MiR-184对神经胶质瘤细胞的作用机制
3.1实验材料..............................48
3.2方法..............................48
3.3结果..............................51
第二部分MiR-184对神经胶质瘤细胞增殖、侵袭的调控
利用Real time PGR方法检测miR-184在正常脑细胞和胶质瘤细胞细胞系中的表达情况。结果可见，与在组织学检测结果相似，miR-184在正常脑细胞和胶质瘤细胞细胞系中均有表达。但在胶质瘤细胞系T98G、U87、A-172、LN229、LN18几种细胞系中的表达增加，与正常脑细胞NHA细胞比较，miR-184增加显著（见图5)。根据表达情况，本研究以下实验选择T98G和U87进行进一步研究。
利用MTT检测miR-184过表达或miR-184抑制后对胶质瘤细胞U87、T98G的影响，分别将iniR-184模拟体以及miR-184抑制剂转染至胶质瘤细胞中，并设立空白对照组，连续观察6天，绘制生长曲线。结果可见，当转染miR-184模拟体后，使miR-184过表达，可见无论是在胶质瘤细胞U87还是T98G细胞系中，均可明显促进肿瘤细胞的增值能力（见图6)；反之，当转染miR-184抑制剂转染至胶质瘤细胞中，人为抑制niiR-184的表达，可见在两种细胞系中，肿瘤细胞的增殖受到抑制（见图7)。说明当miR-184过表达时对肿瘤细胞增殖的促进作用显著强于抑制miR-184的表达，因此表明miR-184可以促进胶质瘤细胞的增值能力。
利用平板克隆形成实验检测miR-184过表达或miR-184抑制后对胶质瘤细胞U87、T98G克隆形成率的影响，分别将miR-184模拟体以及miR-184抑制剂转染至胶质瘤细胞中，并设立空白对照组，观察克隆形成情况。结果可见，当转染miR-184模拟体后，使miR-184过表达,可见无论是在胶质瘤细胞U87还是T98G细胞系中，均可明显促进肿瘤细胞的克隆形成能力，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05)(见图8)；反之，当转染miR-184抑制剂转染至胶质瘤细胞中，人为抑制miR-184的表达，可见在两种细胞系中，肿瘤细胞的克隆形成受到抑制，与空白对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05)(见图9)。说明当miR-184过表达时对肿瘤细胞克隆形成的促进作用显著强于抑制miR-184的表达，因此表明miR-184可以促进胶质瘤细胞的克隆形成率。
第三部分MiR-184对神经胶质瘤细胞的作用机制
细胞增殖是一个复杂的过程，控制这一过程的主要因素是细胞所在环境中的生长因子与细胞内信号通路转导。细胞是一个综合的网络调节体，细胞的各项功能变化对细胞有重要的作用。而当这些信号转导途径的调控发生异常，细胞可能发生增殖，最后发生恶性转化[61]。目前已非常明确PDK/AKT信号对于细胞的增殖调控具有非常重要的作用。2000年发现一组蛋白质家族命名为FOX蛋白，属于新型蛋白质，已经发现其在机体信息系统中有重要调节作用，因此成为研究热点。其中FOXO蛋白是FOX蛋白家族的主要亚家族成员，与肿瘤形成、细胞增殖、生长、分化、代谢、免疫调节等关系十分密切。其中F0X03被证实与细胞转化、肿瘤的发生发展及其血管生成有关。叉头转录因子FoxO家族是AKT激酶的主要勒1蛋白，包括FoxOl、Fox03a和Fox04，其穿梭于细胞核内外,在机体细胞的增殖、分化、调亡、抗氧化应激方面发挥重要作用。Fox01/3a可被AKT憐酸化，并转移到细胞衆被泛素化，通过蛋白酶体途径降解，导致其蛋白水平和转录活性降低AKT在激活状态下可磷酸化其下游的转录因子，导致FOXO蛋白出核，转录活性丧失。FOXO家族分子能够直接转录上调p21cipl、p27kipl,或者转录下调CyclinDl，起到抑制细胞增殖的作用。
综上所述，上调miR-184促进制胶质瘤细胞增殖能力是勒向调节F0X03影响着细胞周期相关蛋白从而影响细胞增殖能力的变化，实验结果表明niiR-184在胶质瘤的发生发展中扮演一定角色。miR-184是否有望成为预测胶质瘤发生发展及预后的生物标记物和治疗的新勒点，本实验提供了一定的理论基础。我们已知人类miRNAs超过1000余种，每种miRNA可调节多个基因乃至上百个基因的表达，本研究的主要目标是miRNA-184在神经胶质瘤中的作用及机制，这只是胶质瘤研究很小的一个方面，尚不能完全阐述胶质瘤的发病机制，无法达到根治目标。且本研究为基础实验研究，与临床试验及临床应用还有很大距离，miRNA-184与临床工作的相关性研究是我们下一步的方向。
参考文献（略）