第一部分 MicroRNA 在 DCM 心肌中的表达谱
一、前言
糖尿病（Diabetes mellitus, DM）是一种进展性代谢紊乱疾病，它能最终导致包括肾衰、失明和心力衰竭等一系列慢性血管并发症的发生[1]。糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy, DCM）是 DM 患者心源性猝死和死亡的主要原因[2, 3]。既往的研究证实：线粒体功能失调和氧化应激在 DM 导致的心脏功能障碍发病过程中具有重要作用[4, 5]。这些分子改变，会导致以心脏收缩功能受损、心肌细胞肥大、心肌纤维化和心肌细胞凋亡为特点的一系列级联病理生理改变的发生，最终导致心理衰竭的发生[6]。但到目前为止，DCM 的确切病理生理机制尚未完全阐明，并且还没有专门针对这一疾病的有效治疗方式。
MicroRNAs（miRNAs）是一种由 18-25 个核苷酸构成的非编码 RNA，它可以通过与靶信使 RNA（message RNA, mRNA）3’-非翻译区的结合，而导致mRNA 的降解或者抑制其转录，从而在基因表达的转录后调节过程中发挥重要作用[7, 8]。特定的 miRNAs 分子在细胞分化、凋亡、坏死、迁移和增生过程中，发挥重要作用[9]。近来的研究证实，DCM 发生、发展过程中伴随着 miRNA 的表达改变，其中 miR-1，miR-141，miR-206 和 miR-223 表达上调，miR-133a，miR-373 和 miR-499 表达下调[10-12]，但 miRNA 在 DCM 发生、发展中作用的具体机制，目前尚未阐明。因此，阐明 miRNA 在 DCM 发病过程中的作用和机制，将有助于明确 DCM 的分子机制以及探索新的治疗方式。
本部分内容通过 miRNA 芯片和实时定量 PCR 的方法对 DCM 大鼠模型心肌组织中异常表达的 miRNA 进行了筛选和验证，并通过检测高糖培养基刺激心肌细胞后这些 miRNA 的表达变化，确定可能影响心肌细胞功能的 miRNA，为下一步深入研究 miRNA 功能和机制提供方向。
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二、实验设备与方法
（一）主要设备
枪头 美国 Axygen 生物技术公司
匀浆机 宁波新芝仪器有限公司
微量移液器（200、100、50 微升） 德国 Eppendorf 公司
移液器（1 毫升） Dragon MED 公司
微量移液器 20/2 微升 德国 Gilson 公司
普通冰箱 西门子公司
聚乙烯管 德国 Eppendorf 公司
倒置相差显微镜 日本 OLYMPUS IMAGING 公司
荧光显微镜 日本 Nikon 公司
JA2003 电子天平 上海天平仪器厂
（三）溶液配制
1、柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L, pH4.2~4.5）
电子天平称取 0.96 g 柠檬酸，以 50mL 去离子水溶解，标记为 A 液；电子天平称取 1.47 g 柠檬酸三钠，以 50mL 去离子水溶解，标记为 B 液。取 28mL的 A 液，22 mL 的 B 液，以去离子水定容至 100 mL，即为 0.1 mol/L 的柠檬酸缓冲液，pH 在 4.2~4.5 之间。
2、STZ 溶液（1 mg/mL）
电子天平称取 50 mg 的 STZ 粉剂，在 50 mL 的柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L,pH4.2~4.5）中。于 30 min 内使用，现用现配。
3、PBS 缓冲液（0.1 mol/L, pH7.2）
电子天平称取 0.2 g 的 KCl，3.48 g 的 Na2HPO4 12H2O，8.0 g 的 NaCl，0.2g 的 KH2PO4，用 800mL 去离子水溶解，调节 pH 至 7.2，定容至 1000 mL。15磅压力灭菌 15 min，4℃保存。
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第二部分 miR-144 对高糖诱导心肌细胞氧化应激和凋亡中的作用和机制
一、前言
氧化应激反应，已经被证实在 DCM 发病、发展过程中具有重要作用。在DM 患者心脏的氧化应激过程中，包括过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、超氧阴离子（oxygen ions，O2-）、羟基和过氧化物根在内的活性氧族（reactiveoxygen，ROS）广泛的参与了这一过程。H2O2是一种弱的氧化物，但是它能够与铁离子发生芬顿反应而产生最强的氧化剂-OH。此外，氮氧合酶（nitric oxidesynthase）能够催化 O2-与一氧化氮（nitric oxide, NO）根结合产生过氧亚硝酸盐（peroxynitrite，ONOO-）, ONOO-能够迅速将具有高氧化能力的氮类氧化剂分解[1]。细胞质和线粒体主要通过酶的催化作用而不断产生 ROS，其中主要包括4 种酶：线粒体呼吸链、NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX），黄嘌呤氧化酶和内皮性氮氧合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）[2]。
同时细胞内也存在相应的抗氧化系统而使细胞内 ROS 产物水平处以相对平衡状态。这一系统通过产生天然解毒分子或者 ROS 清除剂，而发挥上述抗氧化作用，其中主要包括酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、血红素氧化酶-1（hemoxigenase-1，HO-1）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPox）、过氧化氢酶）和非酶分子两类（转铁蛋白、铁蛋白、维生素 A、E 和 C），所有这些抗氧化物质能够作用于特异氧化物而使其无害化[3]。Akhileshwar 等[4]证实：活化 SOD 和GPox 能够改善过氧化氢酶和 GSH 活性。因此通过中和、清除 ROS 或者激活内源性抗氧化防御机制，可能能够改善 DCM 病理过程。然而具体调节上述氧化酶和抗氧化物酶的分子机制现在尚不清楚。本部分内容将以 miR-144 为研究对象，探索 miR-144 在高糖诱导的心肌细胞氧化应激和凋亡中的作用，并阐明其作用机制。
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二、实验设备与方法
1、心肌细胞培养、高糖刺激以及 miR-144 mimic 和 inhabitor 的转染
（1）原代乳鼠心肌细胞的培养见第一部分。高糖刺激前用无血清培养基预处理 12 h 后，更换为高糖培养基，继续培养 24 h，观察细胞形态变化，检测基因表达变化，每次实验至少设置 3 个复孔，且实验需至少重复 3 次。
（2）实验中为了减少试剂用量、细胞铺板疏密度、转染效率等原因所致的实验误差产生，保证结果的可重复和可靠性，实验中需要：（a）必须设置 3 个复孔；（b）细胞铺板前，应将细胞吹打均匀。一般实验中 miRNAmimic 的转染浓度是 25nM，miRNAinhibitor 的转染浓度是 25nM。接种 1×105心肌细胞至含有适量完全培养基的 24 孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到 50~80%。稀释 mimic 或 inhibitor 到设定浓度，加入培养液中，将培养板置于 37℃的 CO2培养箱中培养 24 小时。
（3）心肌细胞铺板后，高糖刺激或普通糖培养+mimic 或 inhabitor 转染组，转染前应在无抗生素培养基中培养 24 小时，转染 24 小时后更换高糖或普通糖培养基，继续培养 48 小时后进行后续研究，同时应将 25mM 的 L-葡萄糖作为对照，以排除由于渗透压对于细胞培养的影响。
按下列体系配制反转录混和反应液，反应液配制在冰上操作，按照要求在实验前将所用枪头及PCR 管进行去RNA 酶处理。
应用 Opticon MonitorTM software 软件分析结果，记录 threshold cycle 值（CT值）。 用内参基因 GAPDH 的 CT 值校正（normalize）所有靶标基因的 CT 值得到 ΔCT 值。比较糖尿病（STZ）组和对照（Control）组的 ΔCT 值得到 ΔΔCT值。最终靶标基因表达量（实验组/对照组）以＝2-ΔΔCT 表示。
基本原理：活性氧类化合物是细胞线粒体电子传递链反应中产生或者其他氧化酶（如 NADPH 氧化酶类、黄嘌呤氧化酶等）催化产生的具有活性的自由基类产物，其广泛参与了细胞和组织病理、生理发生发展的过程。
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第二部分 miR-144 对高糖诱导心肌细胞氧化应激和凋亡中的作用和机制........- 31 -
一、前言.................................................................- 31 -
二、实验设备与方法 .................................................- 31 -
三、实验结果...........................................................- 43 -
四、分析与讨论..........................................................- 48 -
第三部分 miR-144 调控 Nrf2 在 DCM 发生发展中的作用...........- 51 -
一、前言.................................................................- 51 -
二、实验设备与方法 ........................................................- 51 -
三、实验结果..............................................................- 62 -
四、分析与讨论...........................................................- 69 -
结 论...................................................................- 73 -
第三部分 miR-144 调控 Nrf2 在 DCM 发生发展中的作用
一、前言
糖尿病（diabetes mellitus，DM）发病率近年来在全球均呈上升趋势，据统计 2011 年全球大约有 3.65 亿糖尿病患者，预计到 2030 年将达到 5.52 亿人，而其中大部分患者生活于中等或低等收入国家[1, 2]。自 1972 年以来，Rubler 等多位科学界发现一些成年 DM 患者在没有出现高血压、冠心病、瓣膜病的情况下却发生了充血性心力衰竭，于是他们首次提出了“糖尿病心肌病”(diabeticcardiomyopathy，DCM)的概念[3]。研究发现在 1 型和 2 型 DM 患者中，DCM 的早期表现是左心室松弛延缓、左心室僵硬度（stiffness）增加导致舒张功能障碍和收缩功能储备下降[4, 5]。
随着 DCM 的不断发展，患者晚期则以收缩功能不全为其主要表现[4, 5]。DCM 常引起心源性猝死，是糖尿病人群致死致残的主要原因之一。该病的主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡、坏死，肌原纤维大量破坏和丢失，心肌细胞外间质有不溶性的胶原蛋白积聚，从而导致心肌纤维化的发生。DCM 随着时间的发展，心脏出现失代偿时表现为：心力衰竭、心律失常及心源性休克等症状。虽然降低血糖可以显著预防 DCM 的发生，但依靠单一的降糖治疗并不能完全遏止DCM病程的发展，因而降糖治疗并不是DCM的唯一预防策略和治疗手段，并且 DCM 发生的病理生理机制复杂，有必要进行进一步的深入研究，找出除了血糖以外影响 DCM 的其他关键因子，并针对这些因子进行干预，作为预防和治疗 DCM 的新靶点。本部分内容通过尾静脉注射 miRNA antagomir 的方法干预机体 miR-144 水平，检测 miR-144 对 STZ 诱导的小鼠血糖、心功能、心肌肥大和纤维化等进程的影响，探索 miR-144 拮抗剂 DCM 治疗的可行性。
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二、实验设备与方法
1.小鼠 DCM 模型的建立
将 100 只 C57BL/6 小鼠（6 周龄）随机分成 4 组，分别为空白对照组（n=25）、miR-144 组（n=25）、DCM 组（n=25）和 DCM/miR-144 组。DCM 组采用腹腔1 次注射 STZ（150 mg/kg）的方法诱导；空白对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液；miR-144 组在空白对照组基础上行每周 2 次尾静脉注射 miR-144antagomir（20 mg/kg）；DCM/miR-144 组在 DCM 基础上行每周 2 次尾静脉注射miR-144 antagomir（20 mg/kg）。DM 小鼠造模成功后，常规饲料喂养 8 周，以血糖(造模后第 3 天尾静脉取血测血糖，血糖大于 16.7 mmol/l 认为造模成功)和心肌病理改变确认 1 型 DM 建模成功。8 周后至实验终末期后，在心脏彩超检测心功能改变后，以水合氯醛麻醉，断头取心肌组织，心肌标本部分予以行 HE染色检测心肌心肌组织病理改变，Masson 染色检测心肌纤维化改变；TUNEL法检测心肌细胞凋亡数目；活性氧荧光探针法检测细胞内 ROS 生成的变化；Elisa 法检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平；部分予以实时定量 PCR 和western blot 检测相关标志物的表达变化。
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结 论
1. 在心肌细胞中，Nrf2 是 miR-144 的一个直接作用靶点。
2. 体外条件下，给予外源性的 miR-144 抑制剂进行治疗可以通过增加 Nrf2蛋白表达，抑制高糖诱导心肌细胞的氧化应激，从而减轻高糖诱导的细胞凋亡和肥大。
3. 在 1 型糖尿病模型小鼠中给予 miR-144 拮抗剂进行治疗，可以通过上调Nrf2 表达，减轻心肌内氧化应激、凋亡、心肌肥大、纤维化，从而改善小鼠心脏功能。
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参考文献（略）