第 1 章 绪 论
梅毒的临床表现多种多样。在梅毒潜伏期（感染 9~90 天内），感染者无明显症状，梅毒螺旋体从感染部位播散到淋巴中；感染初期，梅毒螺旋体通常只在生殖器区域附近增殖，诱导病理性炎症反应，引发一期梅毒硬下疳；感染后6~8 周，即梅毒硬下疳出现后 4~10 周[1]，梅毒螺旋体开始侵犯皮肤、粘膜和淋巴结，引发二期梅毒疹[2]。早期研究已证实二期梅毒阶段的多种并发症均源于梅毒螺旋体的血行性播散[3]；约 1/3 的未经治疗的梅毒感染患者可发生三期梅毒，三期梅毒的死亡率超过20%[4-7]，这一时期最常累及神经、心脏等器官组织，引发梅毒性脑膜炎、梅毒性心脏病和树胶样肿等临床表征[8-9]。梅毒与艾滋病的传播途径相同，主要有性接触传播、垂直传播和血液传播，且梅毒患者感染艾滋病的风险较正常人大大增加[10-12]。许多研究均指出梅毒患者的 HIV 感染率相较未感染梅毒人群更高。虽然最初以为这仅仅是反映了梅毒和艾滋病的感染和传播方式等危险因素相似[13-14]，但多年来的研究表明这两种疾病之间有复杂的流行病学和生物学关系[15-19]。
梅毒螺旋体与大多数原核型微生物不同，是一种宿主依赖的、无法在体外人工培养的密螺旋体，对外界环境的抵抗力弱，但侵袭力很强，在早期感染中可从皮肤和粘膜直接进入机体，数小时后立即侵入生殖器附近的淋巴结，2~3 天便可入血散布全身，能有效逃避宿主免疫机制，在潜伏数月甚至数年后导致机体内多脏器的慢性病理损害[20]。梅毒感染后续发展的关键在于梅毒螺旋体对宿主靶细胞的早期黏附定植，因此，最早与机体靶细胞接触的梅毒螺旋体外膜蛋白成为了研究的热点。目前，随着分子生物学的迅速发展，以及梅毒螺旋体全基因组序列的全部解析，多种筛选技术——外膜分离方法、基因分析方法和差示免疫筛选方法等也都已广泛用于梅毒螺旋体外膜蛋白的筛选研究。迄今为止，学者们已筛选出多个梅毒螺旋体外膜蛋白并进入研究阶段，其中有 Tp0155[21]、Tromp1/TroA（Tp0163）[22]、Gpd（Tp0257）[23]、TprF（Tp0316）、Tp0453、Tp0483、TprI（Tp0620）、Tromp2（Tp0663）[24]、Tp0751[25]、TprK（Tp0897）[26]、Tp92（Tp0326）和 Tromp3[27]等，Tp92 作为首个在梅毒阳性兔血清中通过差示免疫筛选方法筛选出来的外膜蛋白，可有效诱导动物产生调理素抗体而成为调理素抗体攻击的靶抗原，并通过调理素抗体介导的吞噬作用清除梅毒螺旋体，且这种调理素抗体的出现早于细菌清除作用[28]。Tp92 基因全长 2562bp，开放阅读框架位于梅毒螺旋体的 344276~346837bp，编码的蛋白分子质量为 92kDa，其最大的特点在于抗原性强，序列高度保守，不仅表达于所有梅毒螺旋体中，与其他病原性螺旋体菌株登录序列比较同源度也高达 95.5-100%。另外，Tp92 在其肽链两端有多个多肽转运相关结构域和双亲性 β-桶状结构[29]，与多数革兰阴性菌的外膜蛋白极其相似，其同源蛋白也被发现存在于许多革兰阴性菌如沙眼衣原体( Omp85 )、奈瑟菌属 ( Omp85 )、多杀巴斯德菌(Oma87)、嗜血杆菌属(D15)和幽门螺杆菌(D15)等及其他螺旋体属如伯氏疏螺旋体和钩端螺旋体等表面，是迄今为止已知的唯一一个与革兰阴性菌结构相似并具有同源性的梅毒螺旋体外膜蛋白[30]。Jun HK[31]等人发现在口腔密螺旋体外膜上存在与 Tp92 蛋白同源的 Ti88、Tm88、Tss88 和 Td92 四种蛋白，它们均能刺激 THP-1 细胞中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9（Matrixmetallopeptidase 9，基质金属蛋白 9）和 PGE2（prostaglandin E2，前列腺素 E2）等炎症因子的分泌水平，影响靶细胞黏附分子的表达，促进破骨细胞的破骨作用，从而促进牙周炎的发生与发展，这就提示梅毒螺旋体较强的侵袭力及梅毒感染初期皮肤黏膜炎症与Tp92 可能有着密切联系。目前国内外尚未有 Tp92 在机体感染早期是否能导致皮肤黏膜炎症的相关报道，涉及的信号通路及靶分子则更无从知晓。因此，建立外膜蛋白 Tp92的体外作用靶细胞模型，并进一步探讨 Tp92 可能的作用机制对梅毒的预防和控制具有重要意义。
Jun HK[32]等人证实 Tp92 同源蛋白——Td92 可通过整合素 α5β1 激活 NLRP3/Caspase-1 途径而刺激炎症反应发生，分泌白细胞介素 IL-1β；Liu S[33]等人也发现一些其他梅毒螺旋体外膜蛋白主要是通过激活 MyD88/ NF-κB 和 MAPKs/ p38 途径而引起炎症反应，这就提示 Tp92 是否同样能通过这三条途径之一在感染早期引起皮肤粘膜炎症反应。因此，本研究拟选择 MyD88/ NF-κB、MAPKs/ p38 和 NLRP3/ Caspase-1 三条信号通路为备选途径，选择在机体非特异性免疫中发挥重要抗感染作用的巨噬细胞和梅毒螺旋体早期感染中主要接触的微血管内皮细胞（HMEC-1）为靶细胞，选择最主要的致炎及细胞损伤相关细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 作为炎症反应标志分子，将 Tp92 重组蛋白根据不同浓度和作用时间作用靶细胞，观察 3 种促炎细胞因子的变化水平；采用电镜和乳酸脱氢酶检测等方法了解 Tp92 重组蛋白不同浓度和作用时间对靶细胞的损伤作用。同时采用免疫印迹法检测 Tp92 重组蛋白作用靶细胞前后，MyD88/ NF-κB 通路中关键分子 NF-κB 的水平改变、NLRP3/ Caspase-1 通路中关键分子 NLRP3 和 Caspase-1 的水平改变以及 MAPK/p38 通路中起始分子 p38 MAPK 和 MAPKs 的水平改变，并结合促炎细胞因子及细胞损伤程度变化，以确定主要相关信号通路。再采用 NF-κB 专一性阻断剂 PDTC、NLRP3/ Caspase-1 通路专一性阻断剂 Z-YVAD-FMK 和 MAPKs/ p38 MAPK通路专一性阻断剂 SB202190，观察阻断前后上述 3 种标志炎症分子及细胞损伤程度变化，从另一角度证实主要相关信号通路。最终旨在探讨外膜蛋白 Tp92 可能的信号转导通路，为进一步揭示梅毒螺旋体膜蛋白致病的分子机制打下基础。
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第 2 章 实验材料
2.1 主要实验仪器
超净工作台（YJ-875） 苏州净化设备公司
超声细胞破碎仪 SANYO 公司
垂直电泳仪 美国 Bio-Rad 公司
垂直电泳槽 美国 Bio-Rad 公司
水平电泳仪 北京六一仪器厂
超纯水仪 USFELGAMaxima
电子分析天平（AB204-N） 瑞士 Mettler-Toledo 公司
低速离心机（LXJ-04） 上海医用分析仪表厂
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2.2 载体、菌株及细胞株
E.coli BL21 菌株和 pET-43.1 a (+)载体为南华大学病原生物学研究所保存；THP-1细胞和 HMEC-1 细胞均购于上海瑞鹿生物科技有限公司。
将感染Tp Nichols标准株的兔睾丸组织浸润于0.9% NaCl溶液中并剪碎，用Qiagen基因组提取试剂盒提取梅毒螺旋体全基因组DNA模板，具体步骤如下：
1） 溶解兔睾丸组织：称取50g睾丸组织，剪碎，置于2ml无菌离心管中，加360μl TissueBuffer ATL以溶解组织；
（2） 消化细胞：将40μl 20mg/ml的proteinase K溶液加至离心管中，震荡混匀10s，置于56℃水浴箱中直至完全溶解，1 000rpm离心2min，收集管壁液体至另一2ml离心管中；
（3） 将400μl BufferAL加至离心管，震荡20s，置于70℃水浴箱中孵育10min，1 000rpm离心2min，收集管壁液体至另一2ml离心管中；
（4） 将400μl无水乙醇加至离心管中，震荡混匀20s，1 000rpm离心1min，收集管壁液体至QIAamp Mini spin column（吸附柱）中；
（5） 8 000rpm离心90s，弃滤液；
（6） 将500μl BufferAW1加至吸附柱中，8 000rpm离心90s，弃滤液；
（7） 将500μl Buffer AW2加至吸附柱中，2 000rpm离心3min，将吸附柱置于1.5ml无菌离心管中；
（8） 将50μl Buffer AE（于55℃水浴箱中预热）加至吸附柱中，室温下放置2min后，8000rpm离心90s，将收集的洗脱液分装并储存于-80℃冰箱中。
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第 3 章 实验方法................................................................9
3.1 Tp92 目的基因的扩增 ............................................................ 9
3.1.1 Tp Nichols 标准株全基因组 DNA 模板的提取 ...................... 9
3.1.2 Tp92 的引物设计 ............................................................... 10
第 4 章 实验结果........................................................................29
4.1 Tp92 目的蛋白的诱导表达与鉴定 ............................................. 29
4.1.1 Tp92 基因的 PCR 扩增结果................................................... 29
4.1.2 Tp92/pET-43.1a(+)重组质粒的菌液 PCR 鉴定 ..................... 29
第 5 章 讨论............................................................45
第5章 讨 论
外膜蛋白是 Tp 的重要组成部分，在 Tp 与宿主作用的起始阶段如黏附、侵袭等致病的环节中起着至关重要的作用，因此 Tp 外膜蛋白一直是梅毒分子生物学中研究的热点。有研究证实 Tp 外膜蛋白不仅与 Tp 较强的侵袭力和毒力有关，还是机体保护性免疫的主要靶向目标。如今通过筛选 Tp 外膜蛋白制备疫苗以预防梅毒的研究已取得了一定的成果，但由于 Tp 外膜的易碎（易被理化因素破坏）及菌体细胞壁肽聚糖层的特殊位置（覆盖内膜）等[34]，且目前 Tp 尚不能在体外人工培养，导致蛋白抗原获取困难，更无法对Tp 进行基因“敲入”或“敲出”的研究，使得有关 Tp 外膜蛋白的研究严重滞后于其他病原体，其致病机制更是了解甚少。目前，有研究报道一些病原体外膜蛋白可触发宿主细胞的炎症信号转导通路，诱导炎症因子分泌水平上调，引起细胞损伤和凋亡，从而导致炎症的发生和发展。而早期梅毒的主要病理学变化是生殖器周围皮肤粘膜受损，皮肤毛细血管内皮细胞肿胀、壁周水肿、炎症细胞浸润，因此，本研究致力于筛选和研究 Tp 外膜蛋白 Tp92 的信号转导通路，以揭示 Tp 致机体产生炎症的致病机制。
Tp92，又称 Tp0326，表达于所有的 Tp 菌株中，序列高度保守，同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为 95.5%～100%，具有较强的抗原性。Cameron 等指出在许多可致宿主产生炎症反应的革兰阴性菌外膜上有与 Tp92 同源性较高的蛋白，这些同源蛋白包括脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的 Omp85[35]、多杀巴斯德菌的 Omp87[36]、福氏志贺菌的 Omp90[37]及杜克雷嗜血杆菌和流感嗜血杆菌的 D15[38]，且 Omp85 和 D15 的氨基酸两端均有 β-桶状结构和 POTRA 结构域，与 Tp92 蛋白结构非常相似，同属 Omp85蛋白家族[39-41]，这就进一步提示了 Tp92 与炎症的相关性。另外，有研究指出在四种不同口腔密螺旋体外膜上存在与 Tp92 蛋白同源的 Ti88、Tm88、Tss88 和 Td92 四种蛋白，它们均可高效诱导刺激宿主细胞产生 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9 和 PGE2 等炎症因子，上调宿主细胞中黏附分子的表达，促进破骨细胞的破骨作用，从而促进牙周炎的发生和发展[31]，这也提示了 Tp92 与梅毒感染初期皮肤黏膜炎症可能的密切关系。Jun HK[32]等人研究发现在齿垢密螺旋体（Treponema denticol，Td ）表面的 Tp92 同源蛋白—Td92，可引起牙周炎。Td92 在人巨噬细胞和人牙龈成纤维细胞（PBMC）中可高效诱导促炎细胞因子如 IL-1β 的表达与活化， IL-1β 在牙周炎患者的龈沟液中也呈增长趋势，且其增长幅度与疾病的严重程度呈正相关。研究证实在巨噬细胞中，Td92 与整合素 α5β1 直接相互作用，引起 ATP 释放和 K+流失，并参与 NLRP3 的激活、Caspase-1 的激活和 IL-1β 的转录，即可通过激活 NLRP3/ Caspase-1 途径而刺激炎症反应发生，分泌白细胞介素 IL-1β。而在对一些其它 Tp 外膜蛋白如 Tp0751 的研究中发现，Tp0751 重组蛋白可通过 TLR2 和 CD14 受体激活 MyD88/ NF-κB 和 MAPKs/ p38 途径而诱导巨噬细胞表达促炎细胞因子如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6，引起梅毒感染早期皮肤粘膜炎症[33]。因此，本研究拟选择 MyD88/ NF-κB（也是目前公认的哺乳类生物细胞感染性炎症反应的主要信号转导通路）、MAPKs/ p38 和 NLRP3/ Caspase-1 三条信号通路为备选途径，选择在机体非特异性免疫中发挥重要抗感染作用的巨噬细胞和 Tp 早期感染中主要接触的HMEC-1 细胞为靶细胞，构建 pET43.1a(+)/Tp92 原核表达载体，表达纯化出分泌性重组蛋白后刺激靶细胞，并通过 Western blot、ELISA 和 LDH 总活性比色定量法对 Tp92 可能激活的信号通路进行筛选。
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第 6 章 结 论
1. Tp92 能促进巨噬细胞和 HMEC-1 细胞产生促炎细胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6。
2. Tp92 致使巨噬细胞和 HMEC-1 细胞产生炎症反应可能是通过 NLRP3/ Caspase-1 途径。
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参考文献（略）