第一部分 沙眼衣原体免疫优势抗原的保护性评价及感染依赖性抗原的筛选
前 言
衣原体是专性胞内寄生的革兰阴性菌样微生物，根据传染途径和症状不同分为沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis, Ct )、鹦鹉热嗜衣原体（Cps）、肺炎嗜衣原体（Cpn）等，其中沙眼衣原体与人类疾病关系最为密切。Ct 可分为19个血清型及两种传染类型，A、B、Ba及C型主要侵犯眼结膜和角膜，D-K型以及L1至L3血清型主要通过性接触传播。世界卫生组织最近的一份报告指出，在全球每年新增的5亿例性传播疾病（STD）中，9000多万例为Ct 感染，Ct已超过淋球菌成为泌尿生殖道感染性疾病的主要性病病原体[1]。流行病学调查结果显示，由于Ct 感染存在大量的无症状或微症状患者，通常不被发现和治疗，可持续存在数月至数年，最终引起盆腔炎、不孕不育、异位妊娠等严重并发症；此外，Ct感染还可增加HIV感染率及宫颈癌的发病率，成为威胁人类生殖健康的重要因素[2, 3]。虽然Ct感染可以用抗生素治疗，但由于感染后症状常不明显，甚至没有自觉症状，因而很容易被忽视，致使衣原体在宿主体内持续存在，并在人群中广泛传播，造成严重损害。阐明Ct的致病机制，研制安全有效的Ct疫苗是预防和控制Ct 感染性疾病的关键。
Ct与普通细菌及病毒不同，在宿主细胞内增殖有独特的两相生活周期（原体EB和始体RB），这大大增加了疫苗设计的难度。早在19世纪50年代，人们就采用Ct灭活疫苗肌肉或皮下接种预防沙眼，但此方法在提供保护作用的同时，引起超敏反应，原因是Ct菌体含有激发机体保护性免疫及超敏反应的多种成分。近代的许多学者致力于从衣原体菌体寻找亚单位疫苗，其中Ct主要外膜蛋白(MOMP)，占衣原体外膜成分的50%-60%，且位于菌体表面，广泛用于疫苗研究[4, 5]。但无论是重组MOMP、MOMP合成肽、MOMP DNA疫苗以及被动免疫MOMP单克隆抗体等均仅能提供部分保护作用；2007年，Murthy AK用令人信服的实验数据证实具有强免疫原性的分泌蛋白CPAF（蛋白酶样活性因子）也有疫苗保护作用，但遗憾的是其保护作用也不完全[6]；目前，衣原体界普遍认为，单一亚单位疫苗很难在Ct 粘附、侵入、增殖、释放等各阶段发挥作用[7]，开发多价联合的亚单位疫苗并在佐剂、免疫接种途径等方面进行优化是Ct疫苗研究的主要策略。
显然，发现和鉴定更多、更有效、免疫原性更强的Ct亚单位，为Ct联合多价疫苗的设计提供更多的选择，是Ct 疫苗研究工作的当务之急。2010年，本课题组针对Ct 泌尿生殖道感染最常见的血清型D型，制备了世界上第一个衣原体全基因组编码的融合蛋白微阵列，利用该阵列与99份女性Ct泌尿生殖道感染的血清进行ELISA反应，一次性鉴定出了38个可被人类40%以上感染血清优势识别的衣原体抗原[8]，其中许多众所周知的有保护作用的疫苗候选分子，如CPAF、MOMP、OmcB、IncA、Tarp等都在其中，这意味着其它筛选到的尚未评价的优势抗原都可能有保护性，甚至比已鉴定的优势抗原保护性更好，问题是我们该优先选择哪些抗原来进行动物实验的评价呢？
动物模型在致病机制、新药研发及疫苗研制中发挥着重要的作用，Ct生殖道感染常用的动物模型主要是小鼠。小鼠阴道感染Ct D 等血清型后，感染主要集中在下生殖道，且炎症病变轻，很快被机体免疫系统清除，不引起上生殖道病变[9]，因此不适合评估疫苗的保护性；但Ct 有一个变种——鼠肺炎衣原体(Mousepneumonitis，MoPn)，现已被划分为一新的衣原体种，即鼠衣原体(Chlamydiamuridarum，Cm)，与Ct D型基因组同源性超过90%（只有一个可变区不同），其编码产物与Ct 蛋白相类似，且对小鼠的致病性强，小鼠阴道接种后引起的炎症反应和后遗症都与女性生殖道Ct 感染的特点相似[10-11]，是目前评价Ct疫苗保护性效果和致病机制研究最常用的动物感染模型。
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第 1 章 沙眼衣原体免疫优势抗原的保护性评价
Ct泌尿生殖道感染形式日趋严峻，疫苗研究虽取得了一定的进步，但目前仍无疫苗真正应用于临床。本课题组前期采用Ct D型全基因组编码的融合蛋白微阵列与99份Ct泌尿生殖道感染女性的血清进行ELISA反应，鉴定出38个可被人类血清优势识别的衣原体抗原[8]，被将其定义为Ct免疫优势抗原；当这些抗原在MoPn的同源物与MoPn泌尿生殖道感染小鼠的血清进行ELISA反应时，有5种抗原（ArtJ，OmcB，MIP，Inc，HP）能被多种不同品系小鼠MoPn感染血清优势识别[12]，说明这5种衣原体抗原在人和小鼠都具有强免疫原性，其表达可能与衣原体感染致病密切相关，采用MoPn感染的小鼠模型评估这些免疫优势抗原的疫苗保护性，将为人类Ct感染的疫苗设计提供有价值的信息。
本研究采用分子克隆技术，原核表达并纯化这5种免疫优势抗原在MoPn的同源物，与弗氏不完全佐剂IFA及新型佐剂CpG寡脱氧核苷酸混匀后肌肉接种免疫Balb/c小鼠，通过建立MoPn泌尿生殖道感染模型，检测各种优势抗原免疫的小鼠在受到衣原体阴道感染攻击后, 其下生殖道衣原体清除情况及上生殖道组织病理学变化，以评价这5种优势抗原对衣原体MoPn的生殖道感染是否有保护性作用，并初步探讨其免疫保护机制。
1.1 材料
1.1.1 主要实验仪器
PTC200 PCR 仪 MJ Research 公司
电泳槽 Bio-Rad 公司
垂直电泳仪 Bio-Rad 公司
K-50U 超纯水仪 Kemflow 公司
细菌摇床 Formal 公司
超声破碎仪 SANYO 公司
低温离心机 Sigma 公司
1.1.2 实验动物、菌株、细胞株
1.1.2.1 实验小鼠
3～4 周龄雌性 Balb/c 小鼠，购于 Jackson Laboratories（Bar Harbor，Maine，USA），由美国得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心( UTHSCSA )动物部饲养。
1.1.2.2 菌株及细胞株
C. muridarum Nigg stain（即MoPn)，由加拿大马尼托巴大学Dr. Brunham教授惠赠，本室自行传代保存并纯化EB；E.coli XL-1 Blue 购自stratagene公司；HeLa细胞，购自美国标准菌株保存中心（ATCC，cat# CCL-2.1)。
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第 2 章 Pgp3 蛋白滴鼻与肌肉免疫保护性效果比较
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）质粒编码蛋白Pgp3是一种能分泌到宿主细胞胞浆的分泌性蛋白，由264个氨基酸编码，生物信息学分析发现该蛋白具有多个亲水性区域，提示可能存在多个抗原表位[14]。我们课题组的前期研究已证实Ct STD感染患者的血清中存在高滴度的抗分泌性蛋白CPAF (衣原体蛋白酶样活性因子)和Pgp3的特异性抗体，其血清反应阳性率分别为94%和96%[8]，众所周知CPAF已被人们广泛应用于疫苗的研究，并能诱导机体产生一定的免疫保护作用，而同为分泌性蛋白且具有强免疫原性的Pgp3疫苗研究较少，仅有相关核酸疫苗研究显示Pgp3 DNA具有一定的保护作用[16-17]，因此本研究采用重组Pgp3蛋白，与新型免疫佐剂-CpG寡脱氧核苷酸和/或弗氏不完全佐剂佐剂（IFA）联合，经滴鼻或肌肉注射途径免疫小鼠后，通过建立鼠沙眼衣原体(Chlamydiamuridarum, Cm或MoPn) 生殖道感染模型，评价Pgp3蛋白不同途径免疫的小鼠在受到生殖道衣原体感染攻击后，其下生殖道衣原体清除情况及上生殖道组织病理学变化，探讨Pgp3蛋白亚单位疫苗免疫保护效果并比较不同接种途径对疫苗保护性效果的影响。
2.1材料
2.1.1 主要实验仪器
细菌摇床 Formal 公司
Olympus AX-70 荧光显微镜 Olympus 公司
CO2 培养箱 SANYO 公司
酶标仪 Sunnyvale 公司
2.1.2 实验动物、菌株、细胞株
2.1.2.1 实验小鼠
3～4 周龄雌性 Balb/c 小鼠，购于 Jackson Laboratories（Bar Harbor，Maine，USA），由美国得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心( UTHSCSA )动物部饲养。
2.1.2.2 菌株及细胞株
C.trachomatis serovar D (Ct D型标准株)、 MoPn Nigg株及纯化的MoPn EB,由UTHSCSA钟光明实验室保存；HeLa细胞，购自美国标准菌株保存中心（ATCC，cat# CCL-2.1)。
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第 2 章 Pgp3 蛋白滴鼻与肌肉免疫保护性效果比较 ........... 39
2.1 材料 ............................................. 39
2.2 方法 ............................................. 40
2.3 结果 ............................................. 43
2.4 讨论 ............................................. 53
2.5 结论 ............................................. 55
第 3 章 沙眼衣原体全基因组编码的感染依赖性抗原的筛选.....57
3.1 材料 ............................................. 57
3.2 方法 ............................................. 58
3.3 结果 ............................................. 63
3.4 讨论 ............................................. 73
第二部分 沙眼衣原体糖原代谢相关酶类物质的定位及GlgA 蛋白的生物学特性研究
前 言
Ct具有独特而保守的胞内二相发育周期，包括原体（elementary body, EB）和网状体（reticulate body, RB）两种形态。EB吸附于易感细胞表面，诱导内吞形成包涵体，EB在包涵体内发育成RB，RB再以二分裂形式繁殖，并最终转化为子代EB释放出细胞外，感染邻近细胞开始新的周期。为确保成功的胞内生存、复制和再感染，衣原体必须克服重重障碍[58]。首先，EB吸附于泌尿生殖道或呼吸道等黏膜上皮细胞后，需诱导无吞噬作用的上皮细胞主动吞入EB；其次，一旦进入胞内，EB在包涵体内分化发育，需抑制包涵体和溶酶体的融合，并从宿主获取营养物质或代谢中间产物；另外，衣原体感染早期和中期需竭力保持宿主细胞的完整性以完成其在细胞内的发育周期，晚期则诱导凋亡、促进EB释放；最后，一旦EB释放，还需抵抗外环境中天然免疫分子和细胞的杀伤。
衣原体蛋白酶样活性因子（chlamydial protease/proteasome-like activity factor，CPAF）是目前研究最多的一种衣原体分泌蛋白，在EB感染宿主细胞约16小时后分泌到宿主胞浆。已有大量实验证实CPAF可以降解宿主转录因子USF-1和RFX5，调节受染细胞MHCⅡ分子的表达，逃避机体的免疫识别[46]；CPAF可降解BH3-only蛋白（BCL-2的促凋亡家族成员），防止感染细胞因胞内压力变化而诱发凋亡[64]；CPAF可裂解细胞骨架蛋白，如角蛋白8和18等，导致衣原体包涵体周围的细胞骨架松弛，促进包涵体扩大和维持细胞的完整性[47]。然而，对CPAF以及其他已发现的衣原体分泌蛋白的广泛研究，仍有许多不能解释的现象，如衣原体如何调控EB→RB→EB的分化；EB释放后再次感染邻近宿主细胞时，依靠什么方式避免黏膜中各种抗菌因素（如防御素、溶菌酶、补体等）的损伤等？且2012年，Tan M 等用令人信服的实验数据证实已经发现的16种可被CPAF降解的宿主蛋白，有11种是不成立的（使用不恰当的蛋白酶抑制剂而人为造成的假象）[65]，这在衣原体界引起轩然大波，人们在思索CPAF真正作用的同时，也在寻找能进一步解释衣原体胞内生存和感染机制的新的衣原体分泌蛋白。
Ct 的化学组成和细菌相类似，其干重35%左右是蛋白质，40～45%为脂肪，1～2%为糖类。Ct 能够独立合成并分解利用糖原，其基因组有编码糖原合成和分解代谢必须的所有开放读码框（ORFs）[24]，这些ORFs编码蛋白的表达受衣原体质粒调控，Ct质粒缺失株糖原合成减少，且不能引起生殖道感染小鼠出现输卵管病变[66-67]。采用碘染色可见Ct包涵体内有着棕褐色的糖原团块[68-69]，电镜观察发现Ct 感染细胞后合成的糖原颗粒主要分布在包涵体腔而非衣原体菌体[70-71]，说明衣原体可以将合成的糖原释放到菌体外，或者衣原体可以直接在菌体外合成糖原。那么，与糖原合成及分解代谢有关的酶内物质，分布在哪里呢？由于衣原体的糖原代谢与衣原体的致病密切相关，因此本研究拟定位衣原体糖原代谢相关酶类物质，并研究其生物学特性，为衣原体致病机制研究提供新线索。
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2.5 结论
（1） 糖原合酶 GlgA 蛋白在衣原体感染细胞广泛分布，与胞浆分泌蛋白 CPAF的分布模式不完全相同；
（2） GlgA 蛋白在 Ct 感染细胞 12h 后开始表达，24h 后分泌入宿主胞浆，细胞分泌率与 CPAF 蛋白无差异，分泌现象在 Ct 所有血清型/生物型普遍存在；
（3） 外源性表达 GlgA 蛋白显著升高细胞糖原浓度，但不影响细胞对衣原体感染的敏感性；
（4） GlgA 蛋白较其它糖原代谢相关酶类物质的免疫原性强，被 Ct 急性或慢性生殖道感染患者血清的识别频率有显著性差异，可能与其它 Ct 相关抗原联合开发为衣原体急性感染的诊断指针。
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参考文献（略）