引言
唐古特白刺果（ Nitraria tangutorum Bobr NTB ）为蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（Nitraria）落叶灌木植物,据大量文献报道出 NTB已从果籽到果皮进行了系统的研究，发现它具有抗氧化、抗疲劳、降血脂、耐寒冷、调节免疫功能等作用[1]。在免疫学研究方面，认为它主要有显著增强小鼠单核巨噬细胞吞噬功能和小鼠血清溶血素生成的作用，樊莲莲等［2］采用亚急性衰老模型小鼠灌胃白刺果中总黄酮发现它具有抗氧化、延缓衰老的作用。索有瑞等［3］研究出白刺果实具有调节免疫、抗疲劳和耐寒冷等作用。白刺中提取的籽油还可使小鼠负重游泳时间显著延长，运动后血乳酸含量比对照组小鼠低40%，而肝糖元含量显著增高［4］。他们还对［5］对唐古特白刺提取的籽油进行了动物实验发现它具有保护化学性肝损伤作用，但唐古特白刺果对 IFN-γ、T/NK细胞的影响尚未涉及。
T 细胞在细胞免疫中发挥着重要作用, 它还参与 B 细胞产生抗体的过程。特别是辅助性 T 细胞(T helper、 Th、CD4+)和抑制性 T 细胞(T suppressor、Ts、 CD8+)在免疫应答过程中起着至关重要的作用，其比值(T4/T8 比)对判断免疫平衡是常用指标。而自然杀伤细胞(natural killer cell， NK)是固有免疫系统中一类十分重要的淋巴细胞、约占淋巴细胞总数的 15%。NK 细胞通过发挥细胞毒作用和分泌细胞因子，在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥着重要的免疫功能。
本实验从这方面入手，在与具有抗疲劳、耐缺氧、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、能够提升巨噬细胞吞噬指数的黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.LRM）系茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L.）多年生棘刺灌木进行对照的情况下，提取具有多种生物活性并且在免疫方面具有独特功能的多糖（polysaccharide）来探讨 NTB 多糖对 IFN-γ、T/NK 细胞的影响。
NTB 及 LRM 的免疫学研究尚处于起步阶段，有关报道不多，故本研究通过NTB 及 LRM 多糖治疗前后免疫受抑小鼠外周血 IFN-γ，T/NK 的变化，探讨 NTB多糖及LRM多糖的免疫调整机理并为NTB及LRM相关产品的开发提供实验依据。结合目前国内外处于亚健康状态且其免疫力低下人群逐年增多的实际状况，可开发 NTB 及 LRM 系列保健产品，使 NTB 及 LRM 资源得到综合利用。
第一章 超声-微波协同提取唐古特白刺果多糖与黑果枸杞多糖
超声波是一种机械波，它是一种通过强烈震动、空化作用等物理过程来提取有效成分的分离技术，通过超声波的热效应及搅拌作用促使溶剂分子渗透到组织细胞中，从而使得活性成分被释放[6]。微波提取具有选择性高、提取时间短及易挥发性成分的提取率高等优点[7-8]。但每一种提取方法都有它不足之处，如微波提取时遇到的受热不均等现象。超声-波微波协同提取是近年来较新型的提取方法，因其有提取率高、提取时间短、提取物结构受影响程度低等优点，已被广泛应用在生物活性物质的提取方面[9-10]。目前尚未见采用超声-微波协同法提取 NTB 多糖，但汪河滨等[11]对 LRM 多糖提取采用了此方法。故本实验采用此方法提取 NTB 多糖及 LRM 多糖进行对比。
1.1 材料与方法
1.1.1 实验原料
2014 年 8 月采自柴达木盆地天然白刺林场，黑果枸杞购自诺木洪个体户。烘干后常温储存。（原植物经中国科学院西北高原生物研究所索有瑞研究员鉴定为柴达木产唐古特白刺果及黑果枸杞）本试验所用试剂除特别标出的外，均为分析纯，购于试剂公司。
1.2 实验方法
1.2.1 NTB 果粉与 LRM 果粉的制备
枯叶、病果等，将 NTB 干果与 LRM 干果装入超微细粉碎机中粉碎，应注意避免机器负荷过大而影响粉碎效果。将粉碎后的果粉过 60 目筛网过筛，收集过筛后的 NTB 果粉与 LRM 果粉置于封口袋中保存备用。
1.2.2 NTB 果粉与 LRM 果粉的脱脂
植物果粉包含的脂类物质一般不易溶于水，但在水提液表面会形成脂肪漂浮层，影响植物后续提纯操作，因此首先要进行脱脂步骤。将粉碎后的 NTB 果粉与 LRM 果粉每份称取约 1000g 左右，至于圆底烧瓶中加入 4 倍体积石油醚，开启水浴锅 60℃回流提取 3 次，每次 4h，将提取的 NTB 果粉与 LRM 果粉置于常温使其挥发掉石油醚溶剂后再放于烘箱中45℃低温烘干1.5h，收集烘干后的NTB果粉与 LRM 果粉于封口袋中储存备用。
1.2.3 NTB 果粉与 LRM 果粉除单糖
单糖是不能够再水解的糖类，易被碱性弱氧化剂氧化这表明它还具有还原性，故叫做还原糖。因本实验提取多糖做后续的免疫学实验，为避免影响后续的实验故进行除单糖步骤。脱脂过后将 NTB 果粉与 LRM 果粉置于圆底烧瓶中加入 10 倍体积 80%乙醇，85℃ 回流提取 3 次，每次 2h，过滤，挥干溶剂备用。
1.2.4 NTB 果粉与 LRM 果粉超声-微波协同提取
已除单糖的 NTB 果粉与 LRM 果粉超声-微波提取多糖条件为：超声波提取时间 1h、温度 40 ℃、频率 40KHz , 功率 50 W，微波萃取时间 1h 温度 80℃功率400W[12]。
1.2.5 NTB 粗多糖与 LRM 粗多糖溶剂除色
粗多糖含有大量色素成分及小分子物质，据文献报道黑果枸杞花色苷具有抗氧化作用为研究对 T/NK 细胞起调节作用的物质是多糖故在进行脱色步骤，使用过氧化氢除色法。
1.2.6 NTB 粗多糖与 LRM 粗多糖溶剂除蛋白
据资料显示糖蛋白是多糖和蛋白质结合成的大分子复合物，其中，包括透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸软骨素 A、C，硫酸肝素等，这里以透明质酸含量最多，是一长链的大分子，呈曲折盘绕状态。故这些分子对多糖提取有较大的影响，特用 Sevag 法除蛋白：氯仿：正丁醇 4:1 混合比列。
1.2.8 NTB 多糖与 LRM 多糖含量测定（蒽酮-硫酸法）
蒽酮-硫酸试剂的配制：称取200.0mg 蒽酮，溶于浓硫酸中，定容于100ml的棕色容量瓶中，配比成2.0000g/L 的试剂，需当日配制。标准曲线的绘制：精确称取于 105℃烘干至恒重的 100.00mg 葡萄糖标准品。纯水定溶于 100ml 容量瓶中，准确分别吸取 1.0、2.0、3.0、4.0ml 置于 4 个100ml 容量瓶中，再各吸取 2.0ml 分别加入到 6 支 20ml 试管中，以纯水做空白对照，往 5 支试管中分别加入 7.0ml 恩酮-硫酸试剂，加完后立刻置冰水中冷却5min，再将 5 支试管同时放入沸水浴中，加热 10min 后取出放入水中冷却至常温，620nm 波长处检测其吸光度。横坐标为多糖（C,g/ml）浓度，纵坐标为吸光度值（A）。
第二章 NTB 多糖与 LRM 多糖对免疫受抑小鼠 IFN- 、T/NK 细胞的影响 .......9
2.1 实验材料...................................................9
2.2 实验动物及分组............................................10
2.3 小鼠脾脏、胸腺重量及组织结构观察察........................10
2.4 小鼠脾细胞 IFN- 提取 ......................................11
2.5 小鼠血清 IFN- 的测定 ......................................12
2.6 T/NK 细胞亚群分析 .........................................12
2.7 数据处理..................................................12
2.8 结果......................................................12
第三章 讨论 ......................................................18
3.1 免疫抑制低下动物模型的建立.................................22
3.2 NTB 多糖与 LRM 多糖对免疫受抑小鼠免疫调节作用 ...............23
3.3 结论.......................................................24
第二章 NTB多糖与LRM多糖对免疫受抑小鼠IFN- 、T/NK细胞的影响
2.2 实验动物及分组
昆明种小鼠 40 只，清洁级，质量（25±2）g，雌雄各半；购自青海省地方病研究所。随机分为 4 组,正常对照组、模型组、模型+NTB 多糖组和模型+LRM多糖组，每组 10 只，每日定时注射 1 次，模型+NTB 多糖组及模型+LRM 多糖组腹腔注射环磷酰胺 70mg/kg 连续 5 天，造模后腹腔注射 NTB 多糖及 LRM 多糖3.6g/kg[13]连续 10 天。模型组腹腔注射环磷酰胺 70mg/kg 连续 5 天。正常对照组腹腔注射同等量生理盐水。末次给药 24h 后断颈采血，称取脾和胸腺重量，取外周血测定 CD3、CD4、CD8、NK 细胞、血清 IFN-γ及 IFN-γmRNA 的测定。实验期间小鼠自由进食和饮水。
2.3 小鼠脾脏、胸腺重量及组织结构观察
末次给药24h后，断颈处死各组小鼠，无菌取出脾脏和胸腺，小心清除脾脏及胸腺附着结蹄组织，用生理盐水清洗，吸水纸吸干水分后用分析天平称重，计算脾脏指数及胸腺指数。脾脏称重后固定做石蜡切片（详细按石蜡切片实验步骤操作），10X显微镜下观察淋巴滤泡及其结构。
按上述方法取出脾脏后制成脾细胞悬液，采用 Trizol 试剂盒按说明书操作提取总 RNA。所提 RNA 溶于 DEPC 处理水 50μl 溶解，用 5μl 在紫外分光光度计下检测 RNA 的纯度以及定量，总 RNA-80℃保存备用，其余-20℃保存备用。
2.4.1 逆转录（RT）反应合成 cDNA
取上述 mRNA 溶液 10μl，按照逆转录试剂盒操作进行 cDNA 扩增，反应产物即 cDNA -20 ℃保存备用（引物序列见表 1）。
2.4.3 PCR 产物定量
取 PCR 扩增产物 20μl 经 5%琼脂糖凝胶电泳，1%GelGreen 显色后用 Bio Radmycycler 凝胶扫描仪对电泳凝胶中的 PCR 产物条带进行密度扫描，以 β-actin作为 RT-PCR 的质控，计算 IFN-γ的 mRNA 与其对应的 β-actin 峰面积的比值，从而得 NTB 多糖及 LRM 多糖对免疫机制低下小鼠的 IFN-γmRNA 表达的变化。
2.5 小鼠血清IFN- 的测定
上述剩余外周血 0.5ml 分离血清备用。采用双抗体夹心法心 ELISA 法测定血清中 IFN-γ的含量，取 50μl 血清稀释 3 倍后加入酶标板。(具体操作按 ELISA试剂盒说明书严格操作)。
2.6 T/NK细胞亚群分析
外周血 T 细胞亚群的检测小鼠断颈取血约 0.5ml 用肝素抗凝，取 200μl 抗凝血加入单克隆抗体 CD3、CD4、CD8 和 NK(CD49b)荧光标记单克隆抗体 20μl充分混匀，避光孵育 20～35 min 后,标记后的样品分别加入红细胞裂解液,白细胞( WBC) 稳定剂及细胞膜固定剂进行处理后，应用 Becton Dickinson 公司 FACSCalibur 流式细胞仪上机检测。
第三章 讨论
3 讨论
唐古特白刺果丰产性好，果实 8、9 月成熟，味酸多汁，含丰富的黄铜、花青素、红色素、人体必需的 8 种氨基酸、脂肪酸、多糖、生物碱、矿物质元素及维生素等，民间常药用或食用；唐古特白刺果具有一定的药用价值。其气味辛、无毒，中医主治痛肿溃脓、心绞痛、止痛、补肾气、脾胃不和、月经不调、虚寒腰痛等病症，药效显著，被收载于《本草纲目》、《中药大辞典》［14-15］等中医药经典著作中。维药称“阿克羊塔克乌拉盖” ，具有健脾胃、调经活血、降血压、催乳等功效。民间用作治疗高血压和消化不良等疾病。在蒙药中称为“哈日木格”能助消化，健脾胃,还具有安神解表之功效,主治脾胃虚弱、神经衰弱、气血两亏和消化不良等症。在营养成分上，唐古特白刺果实含有一定量的多糖、生物碱、酚类、人体必需脂肪酸，维生素 B1、B2 和 Vc，蛋白质，并含有 8 种人体必需的氨基酸占总氨基酸的 40%［16］，以谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量较高，有利于人体直接吸收［17］。同时果实中含有丰富的微量元素，除常量元素 Ca、Fe、 Na、Mg、K 之外，还含有微量元素 Mn、Sr、Se、Zn、Cr、Cu 等。最有意义的是唐古特白刺果含有较多的多糖和黄铜，经测定其糖含量为 34.56mg/g［18］，具有深远的开发潜力。目前对唐古特白刺果的研究报道较少。王凌云［19］等首次以唐古特白刺果实为原料提取出多糖，用苯酚-硫酸法对唐古特白刺果实多糖含量进行了测定，并对其做了初步的理化性质分析。结果显示，多糖平均含量为 34.56mg/g，提取得率为 48.235%，冷冻干燥后多糖为浅棕色粉末，可溶于水，不溶于氯仿、丙酮、乙醇等有机溶剂，Molish 反应呈阳性，碘化钾-碘反映呈阴性，钠熔法元素分析不含氮，红外光谱在4000~600 cm-1区间有特征吸收峰，且 4h 内稳定性良好；张玲［20］采用柱前衍生 HPLC 法分析白刺果实中水溶性多糖的单糖组成，单糖中甘露糖的含量最高，比葡萄糖高出 9 倍之多。其味甜带苦，白刺果实酸甜极有可能与甘露糖含量较高有关联。目前，临床上唯一能作为营养素的糖质为甘露糖，它能够直接被利用合成糖蛋白，参与免疫调节。
黑果枸杞产量丰富，果实8、9月成熟，味干甜多汁，含丰富的花青素、维生素、多糖及脂肪酸，民间常食用或药用。黑果枸杞具有一定的药用价值，藏药名为“旁玛”，其味甘甜、性平，藏医治疗中用于月经不调、停经、心热病、心脏病、等疾病，且药用效果显著，被收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏医药经典著作中[21-23]；《维吾尔药志》记载，常用黑果枸杞果实及根皮治月经不调、尿道结石、癣疥、齿龈出血等病症，民间用作滋补强壮、明目及降血压药［24］等。在营养成份上，宁夏枸杞与黑果枸杞有着相同的有效成分［25］。经分析数据表明，黑果枸杞含有17种氨基酸（包括人体8种必须氨基酸），3种脂肪酸、蛋白质、还原糖、多酚并且还含有一定量Vc。最为主要的是它具有较多的花青素和多糖,可作为较深远的开发潜力。黑果枸杞果实中还富含多种有益微量元素其果实中的微量元素远比植株部位高,但有害微量元素如Pb、Cd在植株部分含量较高［26］, 近年来国内外对黑果枸杞的研究表明，李进［27］韩彬［28］等对小鼠进行毒理学研究表明黑果枸杞属于无毒物质其小鼠LD50大于24g/kg.bw, 小鼠精子畸变试验中结果呈阴性未出现突变，在30天喂养实验中对动物的身体、脏器的生长发育以及血液生化指标等均无明显不良影响。以上结果表明,黑果枸杞色素有较好的食用安全性,可以作为药、食两用天然色素使用。李彩霞［29］等采用邻苯三酚测定不同溶剂的黑果枸杞果实提取物均有一定的抗氧化作用。李进［30］等研究发现黑果枸杞色素在化学本质上具有一定的抗氧化能力,其具有很强的DPPH清除活性,能显著的抑制小鼠红细胞溶血,能增强小鼠血清抗活性氧能力,抑制小鼠肝组织脂质过氧化产物MDA生成和小鼠肝线粒体肿胀度,并出现一定的量效关系。阿娃汉［31］研究发现含有黑果枸杞色素的果蝇能有效延长寿命,与剂量有关连。李进［32］研究发现给予黑果枸杞色素可降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂。陶大勇［33］研究发现黑果枸杞色素对动、植物性油脂均有抗氧化作用,并随着添加量的加大,其抗氧化性会逐步增加；相同添加量时,色素对植物性油脂抗氧化性强于维生素E、苯甲酸钠,低于维生素C；高温条件下色素抗氧化性稳定。陶大勇［34］研究发现黑果枸杞色素对由环磷酰胺引起的免疫力低下小鼠作用后发现灌喂黑果枸杞色素小鼠的血清和各器官组织SOD升高较半乳糖衰老模型组显著。陶大勇［35］研究黑果枸杞色素对小鼠的抗脂质过氧化活性中小鼠红细胞SOD活性、全血GSH一PX活性及血清GSH一PX/MDA明显升高,MDA明显降低。贾琦珍［36］等用环磷酰胺造成免疫力低下小鼠其巨噬细胞吞噬指数明显升高表明黑果枸杞色素有增强免疫力低下小鼠非特异性免疫功能的作用。
参考文献（略）