第1章 绪 论
大多数胃癌患者就诊时已为中晚期，治疗效果欠佳，5 年生存率低。研究表明，胃癌发病与多种基因异常表达有关，已发现一些基因可作为胃癌发生的标志物，目前应用于临床判断胃癌是否发生的标志物主要有 CEA、CA72-4 和 CA19-9，但其特异性不高[1]。因此，筛选与鉴定胃癌早期诊断的分子标志物，建立胃癌早期诊断的新方法，是胃癌早期诊断、早期治疗、改善患者生活质量、提高 5 年生存率的关键。近年来，通过微阵列及比较基因组杂交等技术对胃癌细胞的 DNA 或 mRNA进行了深入分析，探明了一些与胃癌发病有关的基因。由于蛋白质是一切功能活动的执行者，基因通过转录翻译成蛋白质后还将进行折叠或修饰，所以从 DNA或 mRNA 水平进行研究并不能全面反映出胃癌细胞内蛋白质的变化。随着蛋白组学技术和分子生物学技术的发展，探究肿瘤发生、发展有关的蛋白质分子网络与寻找胃癌早期诊断标志物及其作用机制成为可能。
Pfaffenbach 等[8]发现，IGF-1 受体信号转导通路不依赖经典的 UPR 和FOXO1，而是通过 PI3K/AKT/mTORC1 轴调节 GRP78 的表达，影响细胞增殖；GRP78 也能绑定并调节 ER 重要信号转导通路影响细胞增殖[9]。此外，Sato 等[10]研究人员报道，细胞表面的 GRP78 绑定活化的 α-2 巨球蛋白，再使 Akt 激活，对细胞的凋亡具有抑制作用，同时对 NF-κB 具有正向调节作用，并经过未折叠蛋白反应（UPR），使细胞数量增多。肿瘤细胞表面 GRP78 是肿瘤信号转导和活性的重要调节剂，能快速激活细胞表面其他蛋白受体或配体，能通过磷酸肌醇Ⅲ激酶/Akt 信号通路，调控肿瘤细胞增殖和侵袭转移。然而，有关胃癌组织中GRP78 表达的临床病理意义及其在胃癌转移中的作用机制尚不清楚。
本研究运用免疫组织化学技术，检测胃腺癌及转移胃癌组织中 GRP78 蛋白质表达水平，分析 GRP78 蛋白质表达与胃癌转移、临床分期、病理分型等临床指标的相关性，确定其临床病理学意义。构建靶向 GRP78 的 siRNA，转染 GRP78高表达的 SGC-7901 胃癌细胞，观察 GRP78 表达降低后对 SGC-7901 细胞生长增殖、转移能力的影响及相关基因表达的变化，探讨 GRP78 蛋白促进胃癌转移的相关分子机制，为应用 GRP78 蛋白早期诊断胃癌，提高患者疗效及改善预后提供实验依据。
......
第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 主要设备
倒置显微镜 日本 Olympus 公司产品
4℃及-20℃低温冰箱 Haier 集团产品
-80℃超低温冰箱 日本 Sanyo 公司
可调式微量加样器 德国 Eppendorf 公司
迷你型超速离心机 德国 Eppendorf 公司
精密分析天平 瑞士 Mettler 公司
恒温水浴箱 英国 Grant 公司产品
二氧化碳细胞培养箱 Heal Force 公司制造
2.1.2 主要材料与试剂
收集 2011 年 10 月-2013 年 10 月南华大学附属第一医院行胃癌根治术后并建立电话随访的 48 例病例标本(一般病理特征见表 1)，癌旁正常胃黏膜组织 28例( 癌旁 5cm 以上)，其中高、中分化胃癌 32 例，低分化胃癌 16 例；伴淋巴结转移胃癌组织 26 例。手术标本取材后立即放入液氮罐保存，每例组织标本各取一部分经甲醛固定，制成石蜡切片。SGC-7901 胃癌细胞株由肿瘤研究所保存。
主要试剂：
RPMI-1640 培养液 HyClone 公司产品
胎牛血清 四季青公司产品
0.25﹪胰蛋白酶（含 EDTA） GENVIEW 公司产品
双抗（青霉素和链霉素） GENVIEW 公司产品
甘油 长沙艾杰生物技术公司
RIPA 裂解液(中) 碧云天生物技术公司
苯甲基黄酰氟(PMSF) 长沙艾杰生物技术公司
......
2.2 采取的技术路线和实验方案：
1.使用紫外线对工作台进行消毒，消毒时间半小时为宜，对工作台进行清理，并使用酒精对实验器材以及实验者双手进行消毒；
2.对培养基进行严格消毒，消毒步骤为：首先对培养基的整个瓶身进行酒精擦拭消毒，然后将培养基置于消毒后的工作台上，然后使用酒精灯对培养基的重点部位进行消毒，如瓶口、瓶盖等位置，在酒精灯上加热消毒重点部位，然后再使用酒精棉球擦拭，反复 3-4 次以保证彻底消毒，对瓶口和瓶盖可以同时进行消毒，操作者两手分别取培养基瓶口和瓶盖，在酒精灯火焰两侧进行消毒，保证两者消毒时间和消毒温度一致；
3.再取出一个培养基，将培养基按上述操作进行消毒后，放在操作台的右手边，此时取出存放细胞液的保种管，首先将保种管进行整体酒精消毒，其次对保种管管口进行重点消毒，将保种管管口对准酒精灯火焰，在酒精灯上消毒 3-4 次后，将保种管放置在左手边，然后右手拿移液器，将移液器的吸液口进行高温消毒，需要注意的是移液器不宜距离酒精灯太近或高温下时间太长，以防破坏移液器，快速消毒后插上相应型号的枪头，从保种管中吸取需要剂量的细菌液，并将其注射入培养基中；
4.取一支 5ml 定量移液管，经过高压处理后，按照上述方法进行消毒，然后从保种管中取出 4ml 的细胞液，将其悬空置于一个新的培养基中，对于存放有不同类型细胞液的培养基进行编码标号，以防弄混。将放进细胞液的培养基盖紧瓶盖，并对瓶盖瓶口结合处再次进行高温消毒，主要操纵完成，将超净台收拾干净，废物扔进专用垃圾箱，并关闭试验灯；
5.将放入细胞液的培养基放置在适宜的环境中进行细胞培养，一般选择温度 28℃并含有 5% CO2 的培养箱，将瓶口稍微打开，允许少许空气进入，培养箱底部充入无菌蒸馏水，为保证培养箱无菌环境，需要对液体进行定期更换；
6.培养时间控制在 10-12h，取出培养基前需要先拧紧瓶盖，以防拿出后细菌进入培养基，使用荧光倒置显微镜对培养基中的细胞进行观察，最后更换培养液。
......
第 3 章 结 果........................................... 25
3.1 胃癌组织中 GRP78 蛋白的表达及其临床病理特征分析 .... 25
3.2 细胞转染实验结果 .................................. 29
3.3 qRT-PCR 检测转染 siRNA 后 SGC-7901 胃癌细胞中 GRP78 的表达........... 30
3.4 Western blot 检测转染 siRNA 后 SGC-7901 胃癌细胞中 GRP78的表达......... 31
3.5 GRP78 低表达对 SGC-7901 胃癌细胞增殖能力的影响 ..... 31
3.6 GRP78 低表达对 SGC-7901 胃癌细胞迁移能力的影响 .... 32
第 4 章 讨 论.......................................... 34
第 5 章 结 论........................................... 36
第 4 章 讨 论
近期研究表明，GRP78 在人类的多种肿瘤组织中呈高表达，且其表达水平与肿瘤的分化程度、转移能力有关，抑制 ERK 通路能阻断 GRP78 上调表达，从而促进内质网应激诱导的胃癌细胞凋亡[14-15]。GRP78 高表达与肿瘤血管内皮细胞的耐药有关，并且对血管生成也有促进作用[16]。虽然目前关于 GRP78 是通过何种机制参与肿瘤的发生发展尚未完全明确，但其在多种肿瘤的高表达足以说明GRP78 在肿瘤的发生、发展及预后中可能扮演重要角色。相关研究证实，胃癌合并 GRP78 T / T 和 rs391957 C / T 基因型患者，具有较高死亡率和肿瘤复发率，其基因多态性可以预测晚期直肠癌和胃癌患者的临床结果[17]。因此，GRP78 可能成为判断肿瘤预后有价值的分子标记物[18]，但 GRP78 蛋白的临床应用仍存在不足，因为相同分化程度的肿瘤组织 GRP78 蛋白表达水准不大一致。
有研究结果显示，GRP78 在胃癌组织中的表达明显高于正常胃黏膜组织，然而关于 GRP78 在胃癌组织中的临床病理意义仍存在分歧，Yu[19]的研究认为GRP78 高表达与胃癌的分化程度密切相关，而与胃癌肿瘤的大小、浸润、转移等无关，而 Yao[20]等的研究认为 GRP78 高表达与胃癌肿瘤的大小、浸润、转移、分期有关，但与胃癌的分化程度无关。本实验研究结果显示，GRP78 蛋白的表达与肿瘤体积大小、肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移及临床分期密切相关。胃癌肿瘤的体积越大，GRP78 的表达越高，这可能因为肿瘤组织本身就处在缺氧、低糖的环境中，而随着肿瘤细胞的恶性生长，肿瘤体积越大，组织内缺氧的状况加剧，这将更利于诱导 GRP78 的表达。本实验结果还显示，GRP78 表达阳性率在低分化胃癌组织中较中、高分化胃癌明显增高，在低分化癌中表达呈强阳性，在高、中分化癌中呈弱阳性或者阳性表达，说明 GRP78 蛋白表达水平随着胃癌细胞分化程度的降低而增高。GRP78 表达阳性率在淋巴结转移胃癌组织中明显高于无淋巴结转移胃癌组织，提示 GRP78 可能促进了胃癌的淋巴结转移。而肿瘤大小、淋巴结转移与胃癌临床分期密切相关，因此可以理解 GRP78 表达阳性率在 III、IV 期患者胃癌组织中明显高于 I、II 期患者。
影响 GRP78 表达的因素有许多，其中 BAPTA-AM 和 GMBP1 可下调胃癌细胞中 GRP78 的表达水平[21-22]；而 A23187、维生素 E 琥珀酸酯以及 TM 均可引起GRP78 表达上调[23-25]。饥饿诱导可以诱导细胞发生内质网应激并介导上皮间叶转化（EMT）发生，从而增强胃癌的侵袭转移能力[26]。研究发现，肿瘤细胞表面的GRP78 蛋白是肿瘤细胞多条信号转导通路的重要活化剂，能快速激活细胞表面的其他蛋白受体/配体，并通过 PI3K (磷酸肌醇 3-激酶)/Akt 信号转导通路调节肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌细胞增殖[4-5,27]；Sato 等报导，绑定已活化的 α-2 巨球蛋白到细胞表面的 GRP78 蛋白，也能激活 Akt，抑制细胞凋亡通路，并正调节 NF-κB，诱导未折叠蛋白反应（UPR），促使多种肿瘤细胞增殖[10]。有研究报道，GRP78 表达水平能影响胃癌细胞增殖和侵袭能力，其机制可能是 GRP78 作用下 N-钙粘蛋白和 E-钙粘蛋白的表达发生变化，从而诱导肿瘤细胞产生 EMT[28]。然而关于GRP78是否也能通过PI3K /Akt信号转导通路调节胃癌细胞的增殖及转移能力尚未见相关文献报道。
......
第5章 结 论
1、GRP78 蛋白在胃癌组织中的表达水平与胃癌肿瘤的大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期以及预后密切相关。
2、GRP78 蛋白表达下调能抑制胃癌 SGC-7901 细胞的增殖和侵袭能力。
......
参考文献（略）