第1章绪论
1.1立题依据
1.1.1国内外研究现状
胃癌在全世界属常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率及死亡率均居恶性肿瘤的前列[1]。每年全球范围内约有100万胃癌新发病例，其中亚洲为74%，中国为47%，每年死于胃癌的患者人数为85万[2]。胃癌的发病呈地域性和种族性分布，近年来，胃癌发病呈现出年轻化趋势。胃腺癌起源于胃粘膜腺上皮细胞，其组织学类型分为肠型和弥漫型，肠型胃癌的特点是镜下癌症组织具有腺样管状结构，其发生与饮食、环境危险因素（如幽门螺旋杆菌感染Helicobacterpylori，HP）密切相关。而弥漫型胃腺癌的恶性程度及预后较肠型胃腺癌差[3]。至今为止，胃癌治疗仍然以手术治疗为主要，然而手术切除手术患者仍存在复发的可能性。胃癌的早期发现、早期诊断及早期治疗，是提高胃癌患者5年生存率、改善及提高患者生存质量的关键所在。因此，筛选与鉴定胃癌早期诊断及治疗生物标志物尤为重要[4]。
胃癌发病的分子机制尚不清楚。肿瘤分子生物学研究表明，微卫星不稳定性（Microsatelliteinstability，MSI）、染色体不稳定性、癌基因的高表达、抑癌基因的失活及表观遗传学的改变，导致细胞的增殖、凋亡、周期阻滞等改变，参与胃癌发生、侵袭及转移[5]。有研究资料显示，10-50%的胃癌患者存在MSI。由于环境因素、饮食及感染等原因，亚洲胃癌患者的MSI发生率高于欧洲和美洲。MSI与多项临床参数密切相关，MSI多发生在女性、发病年龄较大，MSI还与粘液性胃癌发生相关。发生MSI的胃癌患者通常能在早期被诊断，因此其预后相对较好[6]。
染色体的不稳定在胃癌中常见，且与胃癌的组织学分型相关[7]。肠型胃癌与染色8q、17q和20q的拷贝数改变相关，弥漫型胃癌与染色体12q和13q拷贝数改变相关[8;9]。Tao等发现胃癌中存在SLC1A2基因的脆性突变位点，导致染色体易位，产生SLC1A2-CD44融合蛋白[10]，该融合蛋白可导致代谢信号通路的异常，影响胃癌细胞的生长。ROS1在胃癌细胞中存在因基因重排和产生融合蛋白[11]。研究发现胃癌患者的17号染色体18个位点可能有杂合性缺失，包括APC、TP53、NME1等多个抑癌基因[7]。而Her2在胃癌中发生扩增，导致Her2蛋白高表达，而激活MAPK信号传导通路，导致细胞的恶性生长与增殖[12;13]。有研究资料显示，癌基因MET编码一个与血小板生长因子结合的跨膜酪氨酸激酶受体，在胃癌中呈高表达，其高表达与肿瘤预后密切相关[14]。纤维生长因子受体（fibroblastgrowthfactorrecepter2，FGFR2）在弥漫型胃癌中呈高表达[15]。
新近研究发现，尾型同源转录因子2基因高表达，可抑制胃癌MGC-803细胞的生长[16]。PPARγ通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，降低SOX9的表达，从而抑制胃癌细胞的增殖[17]。E2F-1在胃癌中表达降低，恢复E2F-1在胃癌MGC-803细胞中的表达，可抑制其生长增殖[18]。表观遗传学的概念，是1942年，由Waddington，CH提出的，即DNA序列结构不发生改变，但基因发生化学修饰，结果导致基因的表达改变[19]。1982年，Feinberg和Vogelstein首次在结直肠癌中发现了表观遗传学改变[20]，表观遗传调控机制包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构及非编码RNA。现有大量研究证实，表观遗传学调控参与肿瘤发生发展的多个过程[21]。
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1.2研究意义
通过本研究可明确miR-124在胃癌细胞及组织中的表达，并探讨miR-124可作为胃癌进展及预后预测的潜在生物学标志物的可行性。通过本研究可找出新的miR-124靶基因，为miR-124作为胃癌治疗的潜在靶点提供理论依据和证据。
虽然手术是治疗胃癌的一个很有效的方法，然而，超过50%的患者术后会复发或者全身转移。化疗已经被广泛用于晚期癌症患者以延长生命。然而，多重耐药（MDR）往往会阻碍化疗的成功。并且对于抑制细胞生长的药物而言，肿瘤细胞内存在两种机制：内在的或者获得性耐药。白血病细胞中miR-138高表达与其多重耐药相关[57]。通过抑制P-糖蛋白和Bcl2的表达，使阿霉素在肿瘤细胞内增加，从而导致细胞凋亡。多重耐药相关蛋白可使抑制肿瘤细胞生长的药物排出细胞外。在耐药细胞株中转染miR-326，可减少多重耐药相关蛋白的表达，使细胞对VP-16和阿霉素的敏感性降低[58]。敲低肿瘤细胞miR-27a和miR-451的表达，可降低P-gp和MRP-1的基因的表达，从而增加细胞毒性药物在细胞内的浓度[59]。MDR细胞中miR-15b和miR-16表达下调，并通过调控Bcl2抑制肿瘤细胞凋亡[60]。miR-15b和miR-16的表达异常，使MDR细胞对化疗更加敏感，从而导致细胞凋亡[61]。这些研究结果表明，miRNAs可提高化疗药物对胃癌治疗的效果。
miRNA与蛋白编码基因一样，具有主要的生物学功能，大多数miRNA在肿瘤中发挥主要功能作用。有的miRNA表现出很强的致瘤特性，而有的miRNA则表现出很强的抑瘤特性。Ghanta等[62]通过自己建立的人类miRNA疾病数据库整理出几十个致瘤miRNA和抑瘤miRNA，并对其功能、表达、进化、基因组分布、靶基因及转录因子等进行了全面的系统生物学分析，发现在功能上致癌miRNA更倾向于促进细胞增殖、抑制凋亡、抑制免疫细胞发育、控制细胞周期等，而抑癌miRNA更倾向于抑制细胞生长侵袭、促进凋亡等。其中关于miRNA可作为抑瘤基因参与肿瘤的发生发展的报道越来越多。研究表明，miR-124在肝癌和宫颈癌组织或细胞中表达下调[63;64]，miR-124可通过靶向CDK6抑制髓母细胞瘤细胞的生长与浸润，也可通过靶向ITGB1抑制口腔鳞状细胞癌的生长[65]，同时miR-124与miR-137能促进CD133+肿瘤干细胞的分化，抑制癌细胞的增殖，细胞周期蛋白激酶CDK6是它们的作用靶点[66]。在最近的研究中，Iliopoulos[67]等发现肝癌细胞中miR-124和HFN4α（肝细胞生成和正常生物功能维持中起关键性作用的重要因子）的活性均受到了显著抑制。同时证实miR-124通过诱导癌细胞自毁的方式抑制了超过80%的肿瘤生长。综上所述，miR-124可能作为抑瘤miRNA参与肿瘤的发生发展。但目前国内、国际对miR-124在胃癌中的表达情况、生物学功能以及分子机制均未见任何报道。
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第2章miR-124在胃癌中的表达及其与临床关系的研究
2.1前言
表观遗传学的概念，是1942年，由Waddington，CH提出的，即DNA序列结构不发生改变，但基因发生化学修饰，结果导致基因的表达改变[19]。1982年，Feinberg和Vogelstein首次在结直肠癌中发现了表观遗传学改变[20]，表观遗传调控机制包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构及非编码RNA。现有大量研究证实，表观遗传学调控参与肿瘤发生发展的多个过程[21]。DNA甲基化，是由DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）催化的胞嘧啶5位碳原子发生甲基化，即基因CpG岛甲基化。基因CpG岛的高甲基化，使基因表达沉默、下调，而去甲基化，则使基因表达高表达[22]。基因CpG岛的高甲基化与胃癌的发生及预后密切相关。Ras相关结构域家族1A基因启动子发生甲基化，促进胃癌的进展[23]。
现有研究证实非编码RNA中的长非编码RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）和miRNA（microRNA，miRNA）均参与了胃癌的发生发展[32]。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，在基因转录翻译的调控中发挥重要的作用。miRNA通过调控基因表达，参与细胞的生长、分化、恶变及炎症等[21]。miRNA在生理与病理过程中发挥重要的作用，参与肿瘤的分化、增殖及凋亡等过程[21]。研究表明，胃癌组织中存在miR-106a和miR-31，以及血清中的miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34及miR-423-5p等表达改变[42]。miR-10在胃癌中表达下降，有可能成为胃癌诊断和治疗靶点[46]。miR-506可诱导胃癌细胞发生上皮间质化，胃癌中miR-506表达异常与患者预后相关[47]。miR-100在胃癌组织中高表达，抑制miR-100的表达，可以激活Notch信号通路，诱导胃癌细胞凋亡[48]。miR-181a可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及转移[49]。miR-1182可通过抑制hTERT表达，抑制胃癌的增殖和转移[50]。miR-141可抑制胃癌细胞的生长和转移[51]。综上所述，miRNA在胃癌的发生发展及转移等过程中发挥着重要作用。
本研究拟通过采用原位杂交技术和qRT-PCR检测miR-124在胃癌细胞及组织中的表达，确定miR-124在胃癌中的表达情况；统计分析miR-124与胃癌患者的性别、年龄、分化程度、组织学分级、肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移等情况，确定miR-124与胃癌患者临床参数的关系；追踪随访，统计分析miR-124表达与胃癌患者预后的关系。
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2.2实验材料
2.2.1细胞系和组织样本
2.2.1.1细胞系
人胃上皮细胞GES-1、人胃腺癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS细胞购自美国模式培养物研究所（AmericanTypeCultureCollection，ATCC），细胞均用含10％胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEM培养，置于37℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中。
2.2.1.2组织标本基本资料
收集2008年1月至2009年12月在南华大学附属第一医院就诊的126例原发性胃腺癌患者的肿瘤组织及癌旁组织。其中，大于等于60岁的患者53例，小于60岁的患者73例；男性患者70例，女性患者56例；高、中分化患者32例，低分化或未分化患者94例；肿瘤大于等于3cm的患者71例，小于3cm的患者55例；TNM分期I-II期患者51例，III-IV期患者75例；有淋巴结转移者88例，无淋巴结转移者38例。随机选择其中16例进行miRNA表达检测。上述组织标本的使用已经由南华大学附属第一医院伦理委员会同意。
2.2.2试剂
2.2.2.1消化酶、聚合酶
Premix酶：美国Thermo公司；
SyBRGreenmix：大连Takara生物公司；
RnaseA、Taq酶：美国Fermentas公司；
DNaseI及蛋白酶K：美国Promega公司。
2.2.2.2常用试剂
hsa-miR-124mimics：美国复能基因公司；
DNAmarker：广州美津生物公司；
lipofectamine2000、lipofectamineRNAiMAX：Invitrogen公司；
M-MLV逆转录酶：Invitrogen公司；
TransMessengerTransfectionReagent：德国QIAGEN公司；
TRIZOLTMReagent：Invitrogen公司；
SABC-POD：武汉博士德公司；
生物素化抗地高辛：武汉博士德公司；
胃蛋白酶：武汉博士德公司；
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第3章miR‐124在胃癌中的作用机制研究..........29
3.1前言........29
3.2实验材料........31
3.3实验方法........36
3.4实验结果........48
3.5讨论........62
3.6小结........68
第4章结论........71
第3章miR-124在胃癌中的作用机制研究
3.1前言
3.1.1.miRNA在肿瘤中的作用机制
第一部分，我们已经讨论了miRNA与肿瘤的关系，多种miRNA在不同肿瘤中表达失调参与肿瘤的发生发展。miRNA参与肿瘤发生发展的机制主要是调控细胞增殖、凋亡、周期阻滞、侵袭转移、血管形成、上皮间质样变（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）及干细胞等。肿瘤中高表达的miRNA促进细胞增殖。miR-328通过靶向抑制TGFβ2抑制黑色素瘤细胞增殖[82]。miR-186和miR-326可作为胰腺导管腺瘤预后预测的靶点，并调控瘤细胞的增殖和迁移[83]。miR-494通过调控PTEN的表达促进宫颈癌细胞增殖[84]。具有抑瘤功能的miRNA可抑制肿瘤细胞增殖。miR-185通过直接靶向VEGFA抑制肾透明细胞癌细胞的增殖并诱导凋亡[85]。抑制结肠癌细胞中miR-183/182/96的表达可抑制细胞的增殖[86]。
此外，miRNA还可促进肿瘤细胞凋亡。在多发性骨髓瘤中，miR-137/197通过靶向抑制MCL-1促进细胞凋亡并抑制体内肿瘤形成[87]。在骨肉瘤细胞中，miR-26可通过下调PFKFB3的表达抑制细胞增殖、迁移，促进凋亡[88]。过表达miR-16可抑制乳腺癌细胞生长、增殖并诱导凋亡[89]。miR-144通过靶向TIGAR抑制肺癌细胞增殖，并诱导凋亡和自噬[90]。过表达Lin28可抑制胃癌细胞BGC-823增殖、迁移，并诱导凋亡和细胞周期阻滞[91]。miRNA在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用。miR-214通过抑制p53的表达促进乳腺癌细胞的迁移[92]。miR-182在结直肠癌中通过抑制forkheadboxF2转录因子促进细胞生长及迁移[93]。miR-30c-2-3p通过下调乳腺癌中TRADD和CCNE1负调控NF-κB信号通路和细胞周期[94]。miR-188-5p在前列腺癌中抑制LAPTM4B的表达从而抑制肿瘤的生长和转移[95]。miR-221/222通过抑制TIMP2的表达促进胶质瘤细胞的侵袭及血管生成[96]。在胃癌组织中，miR-506表达降低，其低表达与预后相关，miR-506通过抑制SNAI2抑制胃癌细胞发生EMT[47]。降低miR-223的表达可逆转胰腺癌细胞对吉西他滨耐药而产生的EMT[97]。miR-125b通过抑制Sema4C的表达调控乳腺癌细胞的EMT[98]。miR-135a通过抑制Arhgef6的表达影响肿瘤干细胞驱动的髓母细胞瘤生长[99]。miR-340通过下调组织纤溶酶原活化因子的表达抑制胶质瘤细胞来源细胞的干细胞特性[100]。miR-106b通过TGF-β/Smad信号通路调节CD44阳性胃癌细胞的干细胞特性[101]。可见，多种miRNA参与肿瘤发生发展的调控，并且在胃癌发生过程中发挥着重要作用。
3.1.2miR-124在肿瘤中的作用机制
研究发现，miR-124可抑制肿瘤细胞增殖。在非小细胞肺癌中，miR-124通过抑制STAT3的表达抑制细胞增殖[72]。miR-124也可通过下调ROCK1的表达抑制胃癌细胞的迁移[102]，其在乳腺癌中也可通过抑制Ets-1的表达影响细胞增殖与迁移[103]。miR-124通过抑制amotL1的表达抑制宫颈癌细胞血管生成拟态及细胞运动[104]。与其它miRNA一样，miR-124参与了肿瘤EMT的调控。在前列腺癌细胞中，miR-124通过靶向调节Slug抑制TGF-α诱导的EMT[105]。miR-124通过增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性从而抑制肿瘤。miR-124通过靶向磷酸二酯酶增加弥漫性大B细胞淋巴瘤对糖皮质激素的敏感性[106]。同时，miR-124可通过抑制R-Ras和N-Ras的表达，抑制胶质瘤细胞生长、增殖，并增加其化疗敏感性[107]。可见，miR-124具有抑制肿瘤生长、增殖及增加化疗敏感性的作用。
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第4章结论
4.1miR-124在胃癌细胞及组织中表达下调，并且与患者的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移及预后密切相关。
4.2miR-124可体外体内抑制胃癌细胞增殖并增加胃癌细胞对5-Fu的药物敏感性。
4.3miR-124的直接靶基因EZH2参与了miR-124对胃癌细胞增殖的调控。
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参考文献（略）