第一部分文献综述
1.植物的耐盐机制
目前，土壤盐渍化是世界性的生态和资源问题，它一直都是造成农作物减产、阻碍农牧业迅速发展的一个主要因素，也是困扰植物学家的一个难关。土壤发生盐碱化以后，直接导致土壤溶液的渗透压增大，土壤的透水性、透气性变差，土壤中可利用的养分减少，使得植物无法正常生长。为了增加盐碱地的利用率，国内外很多学者开始研究盐胁迫对多种植物理化特性及细胞结构的影响。根据植物对盐度的耐受程度不同，我们将其分为盐生植物、非盐生植物和甜土植物。盐生植物就是指能在渗透压超过0.33MPa (相当于单价盐70rmnol/L)的盐渍土壤中正常生长并能完成其生活史的天然植物区系。据统计，全世界盐生植物的种类有1560多种，其中我国的盐生植物种类有424种，约占世界盐生植物总数的1/4。甜土植物通常不具备或具有较弱的耐逆境能力，在他的生长发育过程中只能够承受缓慢的脱水过程，而无法承受自身迅速的脱水。外界高盐环境能引起甜土植物的离子胁迫、渗透胁迫以及次级胁迫，例如营养的失衡和氧化胁迫，这些变化严重干扰了植物体内水分的保持及离子稳态的形成，造成植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。
1.2植物耐盐的生理机制
植物自身会主动发生一系列变化来适应逆境，其中包括光合作用的强度和途径的改变，蛋白质合成、油脂和能量代谢的变化，细胞内渗透保护物质的增加，膜结构的改变，离子外排或区隔化，植物自身的生长周期加快等，这些变化使植物体的结构与功能保持一致。自从1989年Kirst首次报道了耐盐的海洋藻类之后，植物的耐盐性机制开始被广泛研究。这为海洋水产业、盐碱地的开发及生态保护提供了有力的理论基础和技术平台。1990年，BrecklS根据盐生植物的生理和形态学特点，将盐生植物分为真盐生植物(euhalophyte)、假盐生植物(pseudohalophyte)和泌盐盐生植物（recretohalophyte) 3个生理类型, —般情况下，这三类盐生植物的耐盐能力以真盐生植物最高，泌盐盐生植物次之，假盐生植物最低。泌盐植物的耐盐能力在不同的物种之间差异较大，它有着独特的适应逆境的方式，如补血草、柽柳等植物具有盐腺，滨藜属植物具有盐囊泡结构，可以有效地排出多余的盐分，从而维持体内的盐平衡。除此之外，盐生植物还可以通过降低根对离子的吸收，阻止离子向地上部分运输从而减少地上部分的盐离子浓度等保持体内的离子平衡。尽管如此，细胞内的调控仍然是植物耐盐的主要控制手段。
1.2.1细胞内的离子区隔化
不论是在盐生植物还是在非盐生植物中，都普遍具有离子区隔化的能力，只是他们离子区隔化的功能有所区别。在盐渍条件下，植物细胞中不可避免的吸收并积累大量的盐分。对盐胁迫敏感的植物为了减少盐离子对自身的毒害作用，会将吸收多余的盐离子输送到老的组织细胞质中储存起来，舍弃老组织转而保护新生组织的正常生长。相比较于对盐胁迫敏感的植物，耐盐植物一般是把多余的盐离子运输到液泡等代谢不活跃的部位中储存，从而降低细胞内盐离子的浓度，避免其对细胞质区的毒害作用。这种细胞内离子的区隔化还起到了调节渗透压的作用。离子区隔化作用依赖多种跨膜蛋白和离子通道蛋白，细胞膜和液泡膜上的Na+/H+反向转运载体调控着钠离子的定向运输，其动力来源于膜上共存着的H+-ATPase(V-ATPase)和H+-PPase两个氢离子传输泵通过水解ATP或PPi产生的能量。
2. 甲烷酶促反应的研究进展
2.1卤代甲烧（CH3X)与环境
自20世纪30年代以来，氟氯烃（CFCs)类物质就以其优良的理化性质占据了制冷剂、灭火剂、发泡剂等化工产品市场。但是在该类产品应用了近半个世纪以后，科学家发现这类物质对大气平流层的臭氧有极强的破坏作用，相应的导致了温室效应的产生，对全球的生态环境和气候变化都有很大的影响[43]。自此之后，引发了科学家对卤代烃(Volatilehalohydrocarbon, VHC)的广泛研究。卤代甲烷的构成包括一个甲基和一个鹵素原子。在这类有机化合物中，较为常见的几种是氯甲烷(CH3C1)、溴甲烷（CHsBr)还有碘甲浣(CHgl),这些有机物在分解后所得到的无机卤素气体，如氯、溴、碘，对大气中能够阻挡紫外线輻射杀伤作用的臭氧层破坏力很强。因为F原子的活性较高，所以氟甲院（CH3F)在自然界中几乎不存在。大气中的卤代甲焼作为VHC,是把氯离子和溴离子带到大气平流层，对臭氧破坏力很强的卤素载体，他们还与其它一些气候现象的变化相关。在整个大气环境中，氯甲垸的体积分数约占600X10i2，其存活寿命约为1.3-1.5a，而溴甲烷的平均摩尔分数约为9X lO"2,存活寿命约为0.6-0.9a。但是，即使溴甲焼在大气中的浓度没有氯甲烧高，其对臭氧的破坏能力却不容忽视。因此，1^代甲浣含量的动态变化直接影响臭氧层的恢复，对整个地球生态系统都有非常重要的影响。可是甲基溴是在全球被广泛采用的一种熏蒸杀虫剂，应用在温室大棚等农业设施，而联合国的蒙特利尔公约要求发展中国家必须在2015年以前停止这种广谱熏蒸杀虫剂的使用，因此迫切的需要开发一种能够满足环境要求的新型甲基溴替代技术。
2. 实验方法 ....................................27-37
2.1 转基因烟草的耐逆性分析 ...................................27-30
2.1.1 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定................................... 28
2.1.2 转基因烟草的耐盐性研究 ...................................28-29
2.1.3 转基因烟草氯离子含量的测定................................... 29
2.1.4 转基因烟草钠离子...................................29
2.1.5 转基因烟草叶绿素含量的测定 ...................................29-30
2.1.6 转基因烟草生物量的测定 ...................................30
2.2 原核蛋白的表达纯化及蛋白活性的测定................................... 30-37
2.2.1 原核表达载体的构建 ...................................30-34
2.2.2 原核蛋白的表达及纯化 ...................................34-36
2.2.3 酶活性的测定 ...................................36-37
3. 实验结果与分析................................... 37-47
3.1 转基因烟草的耐逆性分析................................... 37-38
3.1.1 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定 ...................................37-38
3.2 转基因烟草的耐盐性研究................................... 38-41
3.2.1 转基因烟草氯离子含量的测定................................... 38
3.2.2 转基因烟草钠离子...................................38-39
3.2.3 转基因烟草叶绿素含量的测定 ...................................39-40
3.2.4 转基因烟草生物量的测定................................... 40-41
3.3 MCT基因的原核表达................................... 41-47
4. 讨论与分析................................... 47-50
结论
对于生物领域来说，卤代甲院-甲基转移酶MCT仍然是一个知之甚少的酶，因为它最初的发现是在环境科学范围内，甲基溴、甲基氯可以通过卤代甲烷-甲基转移酶的催化作用形成，因此对MCT的研究大多是围绕着它的源和汇相关的植物MCT。本实验中将MCT基因转入了非盐生植物烟草中进行异源表达，达到提高植物对氯的耐受力的效果。同时通过转基因手段对甲基^化物外排机制的调控，实现植物自身微量、持续释放CHbBr,能够抑制植物线虫病害，达到减少外源化学药品使用量的目的，奠定一定的应用生物学基础。转基因烟草和野生型中的卤代甲院释放量的分析结果表明，转基因植株甲基氯、甲基溴和甲基碘的释放量明显高于野生型对照，高达约两百倍。
转基因烟草的线虫抗性实验已经表明，在Br—处理下转基因烟草能释放更多的CHsBr,并在一定程度上抑制线虫对转基因烟草的侵染，转基因植株体内的线虫数量明显低于野生型。土壤盐分是制约烟草生长的主要因素之一，它不仅造成烟草产量和品质降低，同时还使土壤板结，降低土壤的利用率。将野生型和转基因烟草进行盐处理后测定其各项生理指标，结果显示转基因烟草对盐的耐受程度明显要比野生型高。但是测定其氯离子含量却出乎意料，没有规律可循。盐生植物对于把体内多余的氯离子排出的机制有很多种选择，其中一种是通过渗透调节作用把氯离子外排到土壤中。但也有另一种可能，即以甲基氯气体的形式将细胞内的氯离子外排到空气中。
分析植物体内氯离子含量不稳定的原因可能是：一、尽管转基因烟草能够持续排出卤代甲浣气体，但植株的排放量相对于其所受到的氯离子毒害来说微乎其微，气体排放量并不能明显的影响植株体内的氯离子含量。第二个可能是卤代甲烷气体的排放仅仅影响了细胞质的氯离子浓度，而不能够影响大量贮存着胁迫离子的液泡内离子浓度，但是本实验采用的测量方法并不能将液泡与胞质分开，因此需要在细胞水平上来测定离子浓度的变化来进行研究分析，而植株水平上的离子变化并不能体现MCT基因对植株耐盐的调控响应。