第一章 前言
1.1β-葡萄糖苷酶研究概况
纤维素是吡喃型 D-葡萄糖以 β-1,4-糖苷键连接而成的直链状大分子（如图）。分子式为(C6H10O5)n，不溶于水和一般有机溶剂。由于 β-1,4-糖苷键的特殊构象可使纤维素分子内部和分子间形成大量的氢键，分子内氢键赋予分子刚性，而分子间氢键的有序排列可形成纤维素的结晶区。这也是纤维素不同于其它多糖的重要特性。在天然纤维素中，纤维素分子一般包埋或嵌合在半纤维素和木质素里形成复杂的网状结构
植物通常含 35-50%的纤维素（按干物质计算），因此纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的可再生资源。我国拥有丰富的生物质资源，每年可利用的生物质原料资源总量等于11.71亿吨标准煤，如果把每年的秸秆用于开发生物能源，可相当于 8 座三峡水电站所产生的电能。纤维素可广泛应用于生产生物乙醇和其它产品。因为纤维素含有 β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖亚基，所以可水解为可发酵的糖。目前，巴西是世界上年产燃料酒精最多的国家，其利用甘蔗为原料以及最新的一种迪丁尼快速水解法（DHR 法）生产酒精的技术得到了认可。
大多数国家生产燃料酒精多使用粮食作物，如美国，使用玉米生产燃料酒精。但是使用淀粉质原料不仅成本高而且在全球粮食危机的背景下不利于长期的发展。燃料酒精作为可再生的能源对缓解能源危机有举足轻重的作用。作为国家的能源战略选择，世界上许多国家都对其进行了深入的研究。如果能利用有效的技术对纤维素进行降解，不仅可以降低生物能源的生产成本而且也降低了对石油等不可再生能源的依赖，是解决全球能源供给的有效途径。
1.1.2 β-葡萄糖苷酶简介
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的一种,可将纤维二糖和可溶性纤维寡糖水解成葡萄糖分子及相应的配基。根据其底物特异性可将其分为烃基 β-葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶。根据其基因序列不同又可分为β-葡萄糖苷酶A和β-葡萄糖苷酶B。作为纤维素酶组分中不可缺少的一部分,β-葡萄糖苷酶在纤维素的降解中起关键的作用。自从 1837 年 I.Liebig 和 Wohler 首次在苦杏仁汁中发现 β-葡萄糖苷酶后，研究者们已经先后在细菌、真菌、霉菌、酵母和植物等中发现此酶，目前研究比较多的是真菌产生的 β-葡萄糖苷酶，而应用最广泛的纤维素酶生产菌株大多数是里氏木霉（Trichoderma reesei）的优良突变株。这些菌株在利用纤维素的过程中容易造成纤维二糖的积累形成反馈抑制，不利于纤维素的降解，因此提高纤维素酶体系中 β-葡萄糖苷酶的活力是提高纤维素水解效率和葡萄糖产量的关键措施。
1.1.3 β-葡萄糖苷酶的应用
1.1.3.1 β-葡萄糖苷酶在食品工业上的应用
β-葡萄糖苷酶作为食品风味剂，可与阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶等风味酶协同作用，促进挥发性糖苷配基的释放从而起增香作用。研究发现黑曲霉 β-葡萄糖苷酶对茶汁、苹果汁等有良好的增香效果，经酶处理后的果汁香气更饱满，口感更醇厚。陶平等研究发现，作为脱苦剂，β-葡萄糖苷酶可以分解青梅中的苦杏仁苷，从而减少青梅的苦味，因此它常作为青梅，橄榄等的脱苦剂。另外，β-葡萄糖苷酶可用于生产低聚龙胆糖，可预防食品中淀粉的老化和保持食品中的水分。
第二章 红树林土壤宏基因组文库的构建及 β-葡萄糖苷酶基因的筛选
2.1 引言
纤维素是世界上公认的地球上含量最高的可再生能源生产原料, β-葡萄糖苷酶在纤维素的降解中起重要的作用，β-葡萄糖苷酶可降解纤维二糖和寡糖为葡萄糖，其活性的高低直接影响纤维素的降解效率。该酶在农业，食品，造纸，能源等行业有着巨大的应用前景。自 1837 年，Wohler 和 Liebig 首次在苦杏仁汁中发现 β-葡萄糖苷酶以来，先后在植物，微生物，动物中发现了该酶，虽然该酶的来源比较广泛，但目前仍存在菌株产酶活力低，成本高，大规模的工业化生产和应用受到限制等问题。宏基因组技术克服了传统微生物培养的瓶颈，直接以环境中的微生物群落基因组为研究对象从分子水平上对微生物的基因片段进行研究，在获取新的具有特殊功能的生物活性物质方面应用前景广阔。红树林中种类众多的未培养微生物中蕴藏着丰富的 β-葡萄糖苷酶资源，因此本章拟采用直接提取法提取珠海淇澳岛红树林淤泥样品中的基因组 DNA，并采用 pUC118 载体构建宏基因组文库，然后利用基于功能的高通量筛选方法从文库中筛选 β-葡萄糖苷酶基因。
第三章 β-葡萄糖苷酶的原核表达…………………… 39-67
3.1 引言……………………39
3.2 实验材料…………………… 39-42
3.2.1 缓冲液及其它试剂的配置…………………… 39-41
3.2.2 质粒与菌株……………………41
3.2.3 酶与试剂盒…………………… 41
3.3 试验方法……………………42-52
3.3.1 感受态的制备……………………42
3.3.2 wz-2 表达载体的构建……………………42-45
3.3.3 转化…………………… 45
3.3.4 重组子的筛选和鉴定……………………45-46
3.4 实验结果和分析……………………52-64
3.4.1 WZ-2 表达载体的构建……………………52-54
3.4.2 WZ-2 重组表达载体的验证…………………… 54-55
3.4.3 IPTG 对重组克隆子的诱导……………………55-58
3.5 讨论……………………64-67
3.5.1 表达体系的选择…………………… 64-65
3.5.2 诱导表达条件的优化…………………… 65
第四章 结论与展望…………………… 67-69
1. 结论…………………… 67-68
2. 展望…………………… 68-69.
结论
（1）本文利用直接提取法直接从红树林土壤样品提取总基因组 DNA，选用pUC118 载体成功构建了红树林土壤基因组文库。通过高通量的筛选方法从文库中筛选到了一个 β-葡萄糖苷酶基因。通过用 BLAST 软件对其进行同源性分析，结果显示该基因与 GenBank 中 Enterobacter mori LMG 25706菌来源的β-葡萄糖苷酶同源性最高，有84%的相似性。该基因片段全长1392bp，编码 463 个氨基酸，预测分子量为 52KDa。
（2）采用大肠杆菌原核表达系统对该基因进行诱导表达及表达条件的优化研究。将该基因连接到 pET-32a(+)表达载体上并转入表达菌株 E. coli BL21 (DE3)中，对重组酶的表达条件进行了优化，结果显示，当诱导前菌体浓度OD600=0.8 时，使用终浓度为 1.1 mM IPTG，于 30℃下诱导 14 h，此时重组酶的表达量达到最高。
（3）对重组酶酶学性质进行研究，发现该酶的最适反应温度为 51℃，最适 pH为 6.4，以 4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（p-NPG）为底物时其 Km 值为 0.408，Vmax 为 444 μM/min。在 1 mM 的浓度下，不同金属离子对酶活性的影响如下：Fe2+、Mg2+、Mn2+、Na+对酶活性有促进作用，其中 Mg2+的促进作用最强，Zn2+、Ca2+、 K+、Cu2+对酶活性有抑制作用，其中 Cu2+、Zn2+的抑制作用最为明显， Li+和 Co2+对酶活性几乎没有影响，而 Hg2+对酶活性有完全的抑制作用。不同化合物对酶的影响如下：EDTA 和 SDS 无论是在浓度为 1mM 还是 100 mM 对该酶都有很强的抑制作用。其中以 EDTA的抑制作用最强。尿素和咪唑在浓度为 1 mM 时对酶活力有较强的促进作用，但浓度达到 100mM 时，尿素的促进作用消失，而咪唑显示出对酶活力的抑制作用。丙酮无论浓度是 1mM 还是 100 mM，对酶活力基本上没有影响，该酶表现出了很强的丙酮耐受性。