本文是一篇药学论文，笔者经过研究，得出结论：在NP状态下CCI模型大鼠手术侧脊髓背角NLPR3炎症小体被大量激活，PF通过药理抑制NLPR3的激活发挥对NP的镇痛作用。
材料与方法
1 材料
1.1 实验动物 同第一部分。
1.2 实验仪器
冷冻切片机（美国Thermo Scientific公司） 除以上仪器外，本部分实验研究中使用的仪器与前两部分实验仪器相同。
1.3 主要试剂和抗体
ML385（美国MedChemExpress公司 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0028）（上海碧云天生物技术有限公司 DAPI（武汉Servicebio生物科技有限公司） 二氢乙锭（武汉Servicebio生物科技有限公司） 兔抗Nrf2（英国Abcam公司） 兔抗Keap（英国Abcam公司） 兔抗IL-1β（英国Abcam公司） 兔抗组蛋白H3（美国Cell Signaling Technology公司除以上试剂和抗体外，其余试剂和抗体同第一部分。
1.4 试剂配制
除以下试剂配制外，其余使用的试剂配制方法同第一部分。 根据课题组的研究和参考文献中的给药剂量，ML385先溶解于少量DMSO中，再用生理盐水稀释至浓度为500 pmol/5 μL。
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2 实验方法
2.1 CCI模型制备
同第一部分CCI模型制备。
2.2 分组及给药
50只雄性SD大鼠随机分为：Sham+vehicle组、CCI+vehicle组、CCI+ML385、CCI+PF和CCI+ML385+PF组。
ML385使用微量注射器注射10 μL至大鼠脊髓L5~6间隙。其余各组采用腹腔注射给药，Sham组和CCI组予以等量生理盐水，连续给药11 d。
2.3 行为学检测
2.3.1 机械痛阈检测 同第一部分机械痛阈检测。
2.3.2 热痛阈检测
同第一部分热痛阈检测。
2.4 组织样本收集
CCI术后第11 d，给药及行为学检测完成后，处死大鼠。部分大鼠收集脊髓腰椎L4~5段，用锡箔纸包裹后装入EP管内液氮冷冻后冻存于−80°C超低温冰箱中，用于Western blot等检测。
其余大鼠暴露脊髓，取出脊髓组织用PBS缓冲液漂洗，立即放入装有适量OCT包埋剂的模具内，调整脊髓组织位置及方向，液氮内冷冻，取出脊髓组织OCT冷冻块−80°C保存，用于冷冻切片制备。
药学论文参考
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结果
1 行为学检测
1.1 机械痛阈检测
机械性痛阈检测结果显示，各组大鼠于术前1 d机械痛阈差异无统计学意义（P>0.05）。与Sham组相比，各组大鼠在CCI术后第3 d机械痛阈出现明显降低（P<0.001）。与CCI组相比，CCI+ML385组大鼠在术后第3 d出现了更为严重的机械痛敏（P<0.05）。与CCI组相比，CCI+PF组在术后第7 d机械痛阈显著提高（P<0.01）；在术后第11 d，CCI+ML385+PF组和CCI+PF组机械痛阈显著提高（P<0.01，P<0.001）（如图10A所示）。
1.2 热痛阈检测
结果显示，各组大鼠术前1 d热痛阈无显著性差异（P>0.05）。与Sham组相比，大鼠在CCI术后第3 d热痛阈显著降低（P<0.001）。与CCI组相比，CCI+ML385+PF组和CCI+PF组在术后第 7 d热痛阈明显提高（P<0.01）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+ML385+PF组大鼠热痛阈有明显提高（P<0.01），CCI+PF组大鼠热痛阈有显著的提高（P<0.001）（如图10B所示）。
以上结果表明，使用Nrf2特异性抑制剂ML385后，大鼠痛觉超敏症状有所加深，但ML385不能消除PF的镇痛作用。
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2 PF对Keap1-Nrf2信号通路蛋白的影响
为了研究Keap1-Nrf2信号通路在PF镇痛作用中的作用机制，本研究采用Western blot实验检测了脊髓组织中各蛋白的表达水平。
结果显示，与Sham组相比，术后第11 d，CCI组大鼠脊髓Nrf2总蛋白无明显变化（P>0.05）。与Sham组相比，术后第11 d，CCI+PF组大鼠脊髓Nrf2总蛋白无明显变化（P>0.05）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+ML385组脊髓Nrf2总蛋白表达水平显著降低（P<0.001）。与CCI+PF组相比，术后第11 d，CCI+ML385+PF组大鼠脊髓Nrf2总蛋白表达水平显著降低（P<0.001）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+PF组大鼠脊髓Nrf2总蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）（如图11B所示）。结果表明ML385可降低大鼠脊髓Nrf2总蛋白表达水平，PF对大鼠脊髓Nrf2总蛋白表达水平无影响。
与Sham组相比，在术后第11 d，CCI组大鼠脊髓Keap1表达水平无明显变化（P>0.05）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+ML385大鼠脊髓Keap1表达水平有明显提高（P<0.05）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+PF组和CCI+ML385+PF组大鼠脊髓Keap1表达水平均无明显变化（P>0.05）（如图11C所示）。结果表明ML385可提高脊髓细胞内Keap1的表达，PF对Keap1的表达无影响。
与Sham组相比，在术后第11 d，CCI组大鼠脊髓细胞核Nrf2含量显著提高（P<0.001）。与CCI组相比，术后第11 d，CCI+ML385组大鼠脊髓核Nrf2含量显著降低（P<0.001）；CCI+PF组大鼠脊髓核Nrf2含量显著提高（P<0.01）。与CCI+PF组相比，术后第11 d，CCI+ML385+PF组大鼠脊髓核Nrf2含量显著下降（P<0.001）（如图11D所示）。结果表明ML385对Nrf2向细胞核转移有抑制作用，PF可促进Nrf2向细胞核转移。
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结果 ......................15
1 行为学检测......................15
1.1 机械痛阈检测......................15
1.2 热痛阈检测.....................15
讨论........................20
1 NP模型选择........................20
2 NLRP3炎症小体参与NP..........................20
结论......................30
讨论
NLRP3炎症小体的激活分启动和激活两步完成，启动过程中，NLRP3炎症小体各组成结构和炎性因子前体成分表达提高，包括NLRP3、pro-IL-1β等[64]。激活后的NLRP3炎症小体可产生caspase-1，促进pro-IL-1β水解为具有生物活性的IL-1β分子[16]。在实验中，PF显著改善了CCI模型大鼠的疼痛行为，降低了大鼠脊髓背角NLRP3和caspase-1表达水平。同时，脊髓背角pro-IL-1β和IL-1β表达水平也明显降低，表明PF对NLRP3的激动和激活步骤均具有抑制作用。
ROS是一类高反应性分子，正常生理状态下，可被机体内的抗氧化分子消除，维持在较低水平。外周神经损伤后，神经炎症可促使细胞产生过量的ROS，进入氧化应激状态。这一过程中通常伴随着NLRP3炎症小体的大量激活[65]。Keap1-Nrf2信号通路是体内调节ROS水平的主要途径，且该通路被报道在NLRP3炎症小体的激活中发挥了重要作用[25]。正常生理条件下，细胞内Nrf2与Keap1结合，Nrf2无法进入细胞核驱动抗氧化基因表达。Keap1-Nrf2信号通路激活后，Keap1与Nrf2分离，游离的Nrf2移入细胞核，驱动的抗氧化基因表达，增强细胞的抗氧化能力，降低ROS水平[66, 67]。且Nrf2可降低NLRP3、ASC表达水平，阻止caspase-1前体切割，抑制NLRP3炎症小体激活[68]。在本研究中，PF对Keap1和Nrf2总蛋白无明显影响，但促进了Nrf2向细胞核转移，降低脊髓背角ROS和caspase-1含量，表明PF对NLRP3炎症小体的抑制作用与其促进Nrf2入核，增强细胞抗氧化性相关。且分子对接模拟显示PF可能与Keap1非共价结合，促使Keap1与Nrf2分离。为了验证这一结果，通过给予CCI模型大鼠Nrf2特异性抑制剂ML385发现，大鼠脊髓背角NLRP3表达上调，大鼠疼痛行为加剧，但ML385不能完全消除PF对NLRP3炎症小体的抑制作用及对NP的镇痛作用。由于PF具有调节免疫细胞功能及活化[69]，调节多种信号通路（MAPKs/NF-κB、PI3K/Akt/mTOR、JAK2/stat3等信号通路）[70]等多种生理活性，课题组推测ML385不能完全消除PF功效与PF可通过多种机制抑制NLRP3炎症小体激活有关，激活Keap1-Nrf2信号通路只是众多分子机制之一，其他机制值得继续深入研究。
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结论
本研究通过对PF的药理作用分析总结，结合NP的发病机制，推测PF可通过其良好的抗炎活性和抗氧化性缓解NP，并以此为依据，采用CCI动物模型，探讨NP的镇痛作用机制。经研究，得出以下结论：
1. 在NP状态下CCI模型大鼠手术侧脊髓背角NLPR3炎症小体被大量激活，PF通过药理抑制NLPR3的激活发挥对NP的镇痛作用。
2. PF对NLRP3炎症小体的抑制作用与其激活Keap1-Nrf2通路调节抗氧化基因的水平，限制ROS水平有关。
参考文献（略）