本文是一篇药学论文，笔者对反柄灵芝子实体的化学研究分离得到18个三萜化合物，其中13个新的三萜和5个已知化合物。其中，化合物4-6代表了3、4-裂环-25、26、27、28-四聚二烷三萜的新碳骨架。根据生源合成途径推测，新型的重排产物（4）是在Aldol反应和Baeyer-villiger反应后得到的。
第一章文献综述
1.1灵芝中的三萜类化合物
1.1.1灵芝中三萜化合物的结构
三萜在中药中广泛分布。它们的结构被认为是来源于无环前体角鲨烯。目前已从自然界中分离和鉴定了2000多种三萜，包括达玛烷、羊毛脂烷、葫芦烷、羽扇豆烷、齐墩果烷等结构类型（Liby et al.2007;Hill et al.2012）。1982年，Kubota首次从灵芝中分离出灵芝三萜（Ganoderma Triterpenoids）——灵芝酸A和灵芝酸B。从那时起，GTs一直是研究热点，众多研究者陆续从许多灵芝蘑菇的子实体、孢子和菌丝体中分离出了四百多种三萜。
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灵芝三萜属于羊毛甾烷型三萜。如下列出的498个三萜化合物具有典型的羊毛甾烷三萜骨架（图1-1），即环A/B、B/C、C/D的反式构型和10β、13β、14α、17β的取代基。在典型羊毛甾烷型三萜骨架的基础上，取代基的数量和位置发生了变化，少数三萜发生了骨架重排。
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1.2灵芝中的杂萜类化合物及其生物活性
灵芝的药理作用和治疗疾病谱十分广泛。灵芝多糖虽具免疫调节作用，但似乎用于解释灵芝功效及适应症的“多能性”有些牵强；灵芝中的三萜虽然已知是被关注的重点，但其仍难以解释灵芝功能的全部或大部分。从中医认为灵芝可补五脏、益肾气、安神来看，其药效物质基础还远没有被阐明。近年来，众多学者对灵芝杂萜的研究提示灵芝杂萜可能是灵芝“多能性”的代表性成分。
杂萜类化合物（Meroterpenoids）是一大类混合生物合成来源的次级代谢产物，部分来源于甲羟戊酸途径。这些代谢物的另一部分可以从其他生物合成途径中获得，其中大多数是聚酮，少数是非聚酮，如氨基酸等（Upadhyay et al.2014）。杂萜在自然界中广泛存在，从陆生植物（Li et al.2012）、海洋无脊椎动物（Lee et al.2005）以及真菌（Nagi et al.2004）和细菌（Gurunathan et al.2013;Cragg et al.1997）中陆续分离出来多种杂萜。其中，杂萜类化合物产量最高的是真菌。
多种研究表明，灵芝作为一种高等真菌，其次生代谢产物中的杂萜的种类丰富，结构多样。自从发现灵芝素A和B（Mothana et al.2000）以来，从灵芝属（灵芝科）中分离出了100多个由莽草酸和甲羟戊酸生物遗传途径杂交而来的芳香杂萜类化合物（Chen et al.2017）。杂萜不仅具有多样的结构骨架，还具有广泛的生物活性，例如NO生成抑制活性（Wang et al.2016）、抗氧化活性（Peng et al.2015;Peng et al.2016）、抗过敏活性（Luo et al.2015;Luo et al.2016）、抗纤维化活性（Zhang et al.2017）、抗乙酰胆碱酯酶活性（Peng et al.2013）、细胞毒性（Niu et al.2006）、抗菌活性（Mothanaet al.2000），以及醛糖还原酶抑制活性。
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第二章反柄灵芝子实体化学成分的提取分离及活性测试
2.1仪器、材料与试剂
2.1.1反柄灵芝的来源
反柄灵芝（G.cochlear）于2019年8月在云南南华购买，由生命科学学院杜双田教授根据形态特征进行鉴定。反柄灵芝标本保存于西北农林科技大学化学与药学院。
2.1.2实验仪器和材料
实验中所使用的主要实验仪器及色谱耗材见表2-1。
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2.2反柄灵芝子实体化学成分的提取分离和结构鉴定
2.2.1反柄灵芝子实体脂溶性浸膏的制备
本研究选取市场上常见且在民间广泛应用的反柄灵芝（Ganoderma cochlear），对其中的化学成分及相关生物学功能进行研究。反柄灵芝子实体烘干，粉碎至干粉（10kg），甲醇浸泡24小时，减压浓缩，重复三次获得总提取物。将甲醇总提取物浓缩后悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取（3-5）次，乙酸乙酯部分减压浓缩得到提取物的脂溶性浸膏570.1 g。
2.2.2单体化合物的提取分离将570.1 g脂溶性浸膏进行硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇体系100:0、100:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、1:1、0:100梯度洗脱，得到Fr.1-Fr.14共14个组分。
甲醇-水(甲醇比例依次为30%、50%、70%、90%、100%）体系进行梯度洗脱，将组分Fr13（43 g）划分为Fr.13.1-Fr.13.9共9个组分。组分Fr.13.6用凝胶柱色谱（三氯甲烷-甲醇，1:1）进行分离，得到Fr.13.6.1-Fr.13.6.3。用石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱进一步分离Fr.13.9.2（500 mg），得到Fr.13.6.2.1-Fr.13.6.2.7。后经凝胶柱色谱（丙酮）和HPLC（甲醇-水，1:1）分离，从组分Fr.13.6.2中分离得到化合物1（21.3mg）和8（6.1 mg）。三氯甲烷-甲醇体系洗脱Fr.13.6.1（900 mg），分离得到化合物2（23.7 mg），然后用HPLC（乙腈−水，1:1）从Fr.13.6.3（111 mg）中分离得到化合物6（3.5 mg）和7（8.2 mg）。组分Fr.13.7（3.9 g）通过硅胶柱层析、HPLC分离和凝胶色谱（丙酮），得到化合物19（23.0 mg）、20（16.2 mg）。
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第三章研究结果......................................78
3.1化学成分的结构鉴定.......................78
3.1.1三萜类化合物的结构鉴定.......................78
3.1.2杂萜类化合物的结构鉴定..............................94
第四章讨论与创新点..............................107
4.1研究结果讨论.....................107
4.2创新点...................................108
4.3展望..............................108
第三章研究结果
3.1化学成分的结构鉴定
3.1.1三萜类化合物的结构鉴定
从反柄灵芝子实体的乙酸乙酯萃取层浸膏中，共分离得到18个三萜化合物（如图3-1）。化合物17为-羊毛甾-7-烯型，其他17个三萜化合物为3,4-裂环-羊毛甾烷型三萜。13个为新化合物，分别为化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17、18。5个已知化合物分别为：fornicatin H（12）、fornicatins E（13）、fornicatins D（14）、fornicatin F（15）、fornicatin A（16）。
药学论文参考
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第四章讨论与创新点
4.1研究结果讨论
综上所述，对反柄灵芝子实体的化学研究分离得到18个三萜化合物，其中13个新的三萜和5个已知化合物。其中，化合物4-6代表了3、4-裂环-25、26、27、28-四聚二烷三萜的新碳骨架。根据生源合成途径推测，新型的重排产物（4）是在Aldol反应和Baeyer-villiger反应后得到的。通过对单晶X射线衍射数据的分析，确定了1和3的绝对构型，并结合光谱数据和生物合成途径确定了其他9种化合物的相对构型。化合物3、11、13、15具有神经营养活性，可显著增加NGF刺激的神经突起的生长。依据神经营养活性测试结果分析，具有29-Me和C-4、C-28末端双键的化合物增强了神经营养活性，而四氢呋喃或氧化戊烯环的形成降低了活性。6/6/5环系统的化合物15在NGF刺激的神经突生长中呈剂量依赖性增加，而7/6/5环系统的11在低浓度下有刺激作用，在高浓度下对NGF刺激有抑制作用。二者的不同可能是由于NGF-TrkA复合物与15或11组合模式不同造成的。此外，GAP43参与了15和11对NGF诱导的神经突起生长的增强，在化合物15的作用下既表现出剂量依赖性，又呈现时间相关性。因此，灵芝属中三萜化合物是其潜在的神经营养活性成分。
对反柄灵芝子实体的化学研究分离得到11个杂萜化合物，其中1个新的杂萜二聚体。经活性测定发现，杂萜二聚体20可以有效抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞中Fe2+升高，逆转缺氧复氧导致的GPX4和FTH1降低，提高心肌细胞生存率。
参考文献（略）