本文是一篇医学论文，笔者认为lncRNA 0.1在PEDV感染Vero-E6细胞后表达量随感染时间的增长而增加；通过RNA干扰技术验证得lncRNA 0.1在PEDV感染Vero-E6细胞诱导自噬的过程中起到了促进自噬的作用。
第1章绪论
1.1研究目的意义
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一类急性传染病，发病猪表现为腹泻、消瘦、精神消沉等特征[1]。当猪感染PEDV之后，病毒的纤突蛋白（S）与宿主细胞细胞膜上的氨基肽酶N（APN）受体结合，病毒侵入宿主的小肠上皮细胞继而引起细胞损伤[2]，肠绒毛膜萎缩、脱落，从而导致猪无法通过小肠正常吸收营养。PEDV对各年龄段的猪群均具有感染力，其中仔猪被感染后表现出的临床症状最为严重，且死亡率最高可达100％。迄今为止，基于原型毒株CV777制成的灭活苗和减毒苗对于减少PED的危害仍具有重要意义，但在近年来的免疫压力下，PEDV的S基因频繁突变，比原型毒株CV777毒力更强的PEDV毒株在中国猪群传播，这使得许多采取常规免疫程序猪场的仔猪大量死亡[3]。因此，新型疫苗的研发[4]、疫苗的升级以及寻找新的药物靶点来发展相关药物研究对减少PED对养猪业造成的损失有着重要的意义。
真核生物通过溶酶体降解胞内物质的这一过程统称为自噬[5]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，属于自噬相关蛋白(ATG)8的同源物。自噬发生时，proLC3经过ATG4的剪切形成LC3Ⅰ,LC3Ⅰ经过ATG7和ATG3修饰后，与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ可稳定存在于自噬小体膜上，LC3Ⅱ的检测被认为是自噬检测的金标准[6]。研究表明，病毒感染细胞可引起细胞自噬，而细胞自噬又会影响病毒的复制[7]。如猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Marc-145细胞自噬进而提高病毒的复制效率[8]，新城疫病毒感染Vero细胞后诱导自噬并在感染期间促进新城疫病毒的复制[9]。我国学者郭思杰等[10]证实了当Vero细胞被PEDV感染后会发生自噬，自噬的发生促进了PEDV的复制。据报道，人源lncRNA-HOTAIR和lncRNA-HOTAIRM1是一类与细胞自噬密切相关的lncRNA分子[11]，在多种癌症和细胞中均有报道。然而，在动物疫病的相关的研究中，lncRNA-HOTAIR的调控作用鲜有报道。
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1.2国内外研究进展
1.2.1猪流行性腹泻的流行状况
猪流行性腹泻最早于20世纪70年代在英国的育肥猪群中被发现，感染猪群表现为水样腹泻且一开始该病发病于母猪以及育肥猪，在仔猪中并不常见，造成的死亡率也偏低。由于一开始对这种疾病并不了解并且PED的临床症状与猪传染性肠胃炎(Transmissible Gastroenteritis of swine，TGE)极为相似，导致在最初爆发时大家一直误以为TGEV是病原。但与TGEV不同的是，感染该病的仔猪仅仅表现为轻度腹泻。人们将其命名流行性病毒性腹泻1型（EDV 1）[12]。随着病毒的不断扩大感染，在五年后的1976年，欧洲爆发了大规模的严重的猪腹泻疫情。与EVD-I不同，此次疫情感染所有年龄段的猪群其中包括新生仔猪和哺乳仔猪，此次造成的死亡率约为30%[13]。1978年，由比利时根特大学的科学家组成的一个研究小组，他们首次满足了科赫法则，并描述了一种类似冠状病毒的病原体(CV777)[14]。此外，他们提供的证据表明，这种新病毒与已知的两种猪冠状病毒(猪传染性肠胃炎和血凝性脑脊髓炎病毒)不同[15]。从那时起，EVD病被称为“猪流行性腹泻(PED)”。
1982年，宣华等人利用胎猪肠组织原代单层细胞成功分离出了PEDV[16]，证实了我国也存在猪流行性腹泻[17]。自2010年至今，猪流行性腹泻在我国各地均有爆发，对我国的养猪业产生了巨大的危害，造成了难以估量的经济损失[18]，并且我国大量科研人员进行流行病学调查后发现，在我国33个省市地区的猪腹泻疫情中，猪流行性腹泻病毒为主要感染源[19]。
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第2章试验研究PEDV的分离鉴定及其S基因的系统发育进化分析
2.1材料与方法
2.1.1试验材料
2.1.1.1病料与细胞
11份腹泻仔猪的粪样和3份仔猪肠组织及内容物均采自于新疆石河子周边猪场、Vero-E6细胞由新疆石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存。
2.1.1.2主要试剂
本实验所需要的试剂见表2-1如下：
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2.2实验方法
2.2.1病料处理
将收集的粪样置于15mL离心管中，按照体积比1：5加入PBS缓冲液重悬，置于振荡器上震荡2min，直至粪样震荡均匀后置于-80℃反复冻融三次，之后将混合液置于4℃离心机6000rpm离心20min，取上清按照终体积千分之一比例添加双抗并颠倒混匀，将混匀的病毒液使用0.22um滤膜过滤后取500μL用于检测PEDV，剩余的病毒液分装于新的无菌1.5mL EP管内作为病毒原液置于-80℃备用。取腹泻仔猪的小肠组织及内容物，将其置于干净的玻璃匀浆仪中，用无菌的手术剪刀将其尽可能地剪碎，加入适量DMEM进行匀浆，将匀浆后的混合物置于一个新的50ml离心管中，按照（小肠+内容物）质量/DMEM体积1：5添加DMEM后按照终体积千分之一比例添加双抗并混匀。振荡器震荡2min后-80℃反复冻融两次，于4℃冰箱过夜浸毒。次日将混合物液置于4℃离心机8000rpm离心40min，按照上述方法分装备用，取500μL用于检测PEDV。
2.2.2原代病毒液PEDV N基因检测
（1）原代病毒液总RNA提取
①取300μL病毒液置于一个新的1.5mL无RNA酶EP管内，添加1mL Trizol反复吹打6-8次后置于冰盒中放置5min，使其充分裂解。
②加入260μL氯仿，将EP管置于振荡器上震荡15s，4℃，12000rpm离心10min，小心吸取上层无色水相并按照体积比1：1添加70%乙醇，上下颠倒6-8次混匀，转入吸附柱中12000rpm离心20s，弃废液。
③添加700μL RW1，12000rpm离心20s后弃废液，添加500μL RW2，12000rpm离心20s后弃废液（重复两次），空离2min，将吸附柱置于干净卫生的环境内晾干。
④将吸附柱置于一个新的无RNA酶离心管中，添加40μL RNase-Free Water12000rpm离心1min洗脱，取1μL用于检测RNA浓度，其余置于-80℃备用。
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第三章PEDV诱导细胞自噬及自噬相关lncRNA分析............................26
3.1材料与方法................................27
3.1.1试验材料.............................27
第四章lncRNA 0.1和lncRNA 9.5在PEDV感染Vero-E6过程中对细胞自噬的影响...........................35
4.1材料与方法..................................37
4.1.1试验材料.....................................37
4.1.2试验方法...............................38
第五章全文总结.........................53
第4章lncRNA 0.1和lncRNA 9.5在PEDV感染Vero-E6过程中对细胞自噬的影响
4.1材料与方法
4.1.1试验材料
4.1.1.1细胞与毒株
人肾上皮细胞系HEK 293T、非洲绿猴肾细胞Vero-E6和PEDV毒株均由新疆石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存。双荧光素酶报告质粒pmirGLO由本实验室保存。
4.1.1.2主要试剂
本实验所需要的试剂见表4-1如下：
医学论文参考
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第5章全文总结
（1）成功分离并鉴定PEDV本地毒株，该毒株为G-II亚型。
（2）成功建立PEDV感染Vero-E6细胞自噬模型，经验证PEDV感染细胞后会诱导自噬的发生；获取两条猴源自噬相关lncRNA分子lncRNA 0.1和lncRNA 9.5的序列信息。
（3）在PEDV感染细胞后，lncRNA 0.1的表达上调，lncRNA 0.1在PEDV感染Vero-E6细胞诱导自噬时起促进作用;在PEDV感染细胞后，lncRNA 9.5的表达上调，lncRNA 9.5可以与miRNA mml-mir-20a-5p靶向结合，lncRNA 9.5在PEDV感染Vero-E6细胞诱导自噬时也起促进作用。
参考文献（略）