第一部分 SDF1-CXCR4 信号通路参与急性炎性痛的发生与维持
炎症造成的疼痛是全球范围内的重大临床问题。大量研究证实细胞因子和趋化因子的增加参与神经元超兴奋状态的形成以及炎性痛敏的产生 (Jietal.2014)。趋化因子SDF1广泛表达于外周和中枢神经系统，通过结合其同源性受体CXCR4发挥多种生物学功能。除了参与免疫和炎症反应以外，SDF1-CXCR4 信号还参与疼痛的调控。神经病理性痛状态下，背根神经节内 SDF1 和 CXCR4 的表达明显增加，且 CXCR4 的高表达至少持续 2 周 (Dubovy et al. 2010)。在脊髓损伤模型中，SDF1 和 CXCR4 的表达从损伤后 2 天开始明显上调，至少持续至损伤后 42天 (Knerlich-Lukoschus etal.2011)。正常大鼠鞘内注射 SDF1 能通过激活 CXCR4受体引起持续 3 天的机械性痛敏 (Reaux-Leetal.2012)。然而，迄今为止，SDF1-CXCR4 信号通路是否参与炎性病理性痛的调控依然不清。最近，电生理研究提示 SDF1 可通过 CXCR4 受体调控神经元的兴奋性以及放电模式。众所周知，电压依赖性钠离子通道（voltage-gated sodium channels,VGSCs）参与细胞兴奋性的形成以及 AP 的产生与传递，其中尤以 Nav1.8 和Nav1.9 最为重要 (Cummins et al. 2007)。有研究显示外周炎症或神经损伤状态下DRG 内中小型神经元内的 Nav1.8 表达上调 (Yu et al. 2011; Yu et al. 2013)。此外，有研究显示炎性介质，如 TNF-α，CCL2 和 CXCL1 可直接增加 Nav1.8 的表达以及初级伤害性神经元的兴奋 (Kao et al. 2012)。因此，我们提出假设认为SDF1-CXCR4 信号调控神经元的兴奋性是由 Nav1.8 的表达变化所介导。本实验中，我们采用 BV 引起的外周炎性痛模型，首先检测了 DRG 内 SDF1 和 CXCR4的表达变化；其次，我们利用 CXCR4 的选择性阻断剂 AMD3100 观察了 CXCR4在神经元兴奋性以及 Nav1.8 表达改变中的作用；最后，我们评价了 SDF1-CXCR4信号与炎性痛行为的关系。
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1．材料
1.1 实验动物
本实验所采用的 180-220 g 雄性 SD (Sprague-Dawley) 大鼠购自第四军医大学实验动物中心并喂养于疼痛生物医学研究所动物饲养室。饲养间维持在 22-26 C 的恒温以及 40-60 %的恒湿环境中，期间给予 12 小时的充足光照 (早上 8:00至晚 8:00)。饲养过程中大鼠可自由饮水与摄食，确保饮水与食物预先经高压灭菌消毒处理。大鼠行为学检测在早 9:00 至晚 6:00 间进行，且保证实验大鼠在行为学测试间已至少适应 5 天，每天不少于 30 分钟。动物实验中的所有操作严格遵守第四军医大学关于实验动物管理和使用的相关规定以及国际疼痛研究学会关于进行实验动物疼痛研究的伦理准则。此外，尽一切努力减少实验大鼠的使用数量和遭受的痛苦。
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2．方法
将一长宽高均为 30cm 的透明有机玻璃盒至于透明玻璃平板上。玻璃平板位于实验平台上高 50cm 的铝制支架上，以便于实验者多方位多角度全面观察大鼠后足的活动。实验操作之前，将大鼠放置于玻璃盒中至少适应 30 分钟，消除大鼠进入陌生环境的焦虑不安。随后，取出该实验大鼠，在其一侧后足底注入致痛剂，注射后立即将大鼠重新放回玻璃盒并开始计时。观察并记录每 5 分钟内大鼠注射側后足的自发性缩足反射次数，连续记录 1 小时。自发性缩足反射次数的多少反映 BV 注射引起的持续性自发痛的程度。将大鼠逐个放入不同的 20X20X25cm 的有机玻璃盒中，玻璃盒的四面用白纸遮住，避免测试过程中临近大鼠之间相互影响。玻璃盒位于高出实验平台 30cm 的金属铁丝网上，确保大鼠的双侧后足良好暴露。待大鼠在玻璃盒内适应 30分钟后，采用一系列不同刺激强度的 Von-Frey 纤维丝 (0.8、 2、 4、 6、 8、10、12、 14、 16、 18、 20、 25、 30、 45 和 60 g) 从下向上垂直刺激大鼠后足底的中央部位，观察大鼠的抬足、缩足或舔足反应。每次测试时，从小刻度开始，刺激持续 3 秒左右，每次刺激间隔大于 10 秒。每个刻度重复刺激大鼠后足底 10 次，若能引起 5 次或者 5 次以上的抬足、缩足或舔足反应，即认为此刻度是大鼠该側后足的 PWMT。
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第二部分 SDF1-CXCR4 信号通路参与急性痛向慢性痛状态的转变
慢性痛是最常见也最难解决的临床问题，给个人及社会带来了巨大的经济负担。然而，迄今为止对慢性痛的发病机制的认识依然不足，严重阻碍了其治疗进展。最近几年，SDF1-CXCR4 信号与疼痛的关系受到很大关注。慢性神经病理性痛状态下，SDF1 和 CXCR4 的表达显著增加，且 AMD3100 能有效抑制慢性痛敏的发生 (Dubovyetal.2010)。此外，SDF1-CXCR4 信号还参与慢性糖尿病神经病理性痛的发生发展 (Menichella et al. 2014)。往往急性组织炎症和损伤完全恢复后，疼痛依然存在且逐渐慢性化 (Treedeetal.2015)。鉴于 SDF1-CXCR4 与慢性痛密切相关且我们在第一部分实验中证实 SDF1-CXCR4 信号参与 BV 引起的急性炎性痛的发生与维持，那么 SDF1-CXCR4 信号参不参与急性痛向慢性痛的转变过程呢？HP 模型是一个公认的急性痛向慢性痛转变的实验动物模型 (Reichling andLevine 2009)。它是指正常状态下足底注射前列腺素仅引起一个持续时间不超过4 小时的机械性痛敏，而在炎性刺激后再在足底注射前列腺素能引起持续时间超过 24 小时的机械性痛敏。本实验中，我们首先利用足底注射 BV 建立 HP 模型；其次，我们评价了外周 CXCR4 受体在BV引起的机械性痛敏以及 HP 中的作用；此外，我们还研究了 SDF1 足底注射能否通过 CXCR4 引起机械性痛敏和 HP；最后，我们探讨了 SDF1 引起机械性痛敏和 HP 的细胞内分子机制。
1．材料
建立模型前，先测定实验大鼠的双侧 PWMT，筛选出 PWMT 值位于 15g 至30 g 之间的大鼠留待下一步实验。筛选后，将实验大鼠轻轻固定，利用 1 毫升注射器将致痛剂（本实验中采用是 BV 溶液，200 μg/50 μL）注入大鼠一侧后足底中心的皮下。随后定期测定致痛剂注射后大鼠的 PWMT 值，观察大鼠机械性痛敏的时程。待大鼠的机械性痛敏完全恢复 (即 PWMT 恢复到 BV 注射前的基础水平，本实验为 BV 注射后 7 天)，再在该大鼠 BV 注射的相同部位注射 PGE2，然后检测 PGE2注射后 1 h，4 h 和 24 h 的 PWMT，鉴定 PGE2引起的机械性痛敏。正常大鼠 PGE2注射引起的机械性痛敏很短暂，不超过 4 h。而在大鼠接受BV 注射后再次注射 PGE2引起的机械性痛敏则明显延长，表明 HP 模型成功建立。为研究 SDF1 能否引起 HP 现象，我们将 SDF1(200ng/10μL) 代替 BV 进行足底皮下注射，后期的 PGE2注射及 PWMT 测定同上述 BV 组。为研究外周 CXCR4 受体是否参与机械性痛敏以及 HP 现象，我们采用两种方式：1）在BV或SDF1足底注射的同时注射CXCR4的选择性阻断剂AMD3100；2）在 BV 或 SDF1 足底注射前的 7 天向 DRG 内注射 CXCR4 siRNA。为探讨 SDF1-CXCR4 信号参与机械性痛敏以及 HP 现象的具体机制，我们在 SDF1 足底注射的同时分别注射多种阻断剂：1）pERK 的阻断剂 U0126（10μg/10 μl）；2）PI3K 的阻断剂 LY294002（10 μg/10 μl）；3）mTOR 的抑制剂temsirolimus (20 μg/ 10 μl)；4）Cordycepin (10 μg/10 μl)。
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2 SNI 模型的建立
戊巴比妥钠麻醉状态下，大鼠取右侧卧位。在实验大鼠大腿股骨外侧的凹陷处切开皮肤与筋膜，随后钝性分离肌肉，暴露肌肉下的坐骨神经主干的三个分支，即胫神经、腓总神经以及腓肠神经。随后在近侧端和远侧段结扎胫神经和腓总神经并剪短结扎之间的神经组织，保留腓肠神经的完整。最后逐层缝合肌肉和皮肤并进行单笼饲养。机械性痛敏在 SNI 后一天即可稳定出现，并长时间维持。DRG 内 siRNA 注射的方法参考前期文献 (Li et al. 2015)。在戊巴比妥钠麻醉状态下，大鼠取俯卧位并将背部垫高。备皮消毒后，在 L4-L6 节段沿棘突纵向切开皮肤筋膜。随后钝性分离肌肉，暴露椎骨及横突并利用咬骨钳剪除部分横突与椎板，完整暴露 DRG 神经节。利用微量注射器将预先配置好的 CXCR4siRNA(10 μM) 注射入 DRG 节内，每个 DRG 节注射 2 μl，每只大鼠注射 L4 和 L5 两个 DRG。对照组大鼠接受等体积对照 siRNA 的注射。注射接受后，逐层缝合肌肉和皮肤，独笼饲养让大鼠至少恢复 5 天。
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第三部分 SDF1-CXCR4 信号通路参与中枢卒中后疼痛的发生与维持.......89
1．材料.........90
2．方法.........91
3．结果.........92
3.1 丘脑内胶原酶注射引起丘脑损伤周边区小胶质细胞和星型胶质细胞的激活 ......92
3.2 丘脑内注射 minocycline 或 fluorocitrate 抑制胶质细胞激活可翻转中枢卒中后疼痛....94
3.3 阻断丘脑 CXCR4 可抑制丘脑内注射 SDF1 引起的中枢卒中后样疼痛.......96
3.4 丘脑内注射胶原酶可引起损伤周边胶质和神经元 SDF1 和 CXCR4 表达的上调 .........97
3.5 丘脑内阻断 CXCR4 可抑制胶质细胞的激活和神经元的活化 ....99
3.6 丘脑内阻断 CXCR4 不仅可预防中枢卒中后疼痛的发生还可以翻转其维持 .....101
3.7 抑制低氧诱导因子 (HIF-1α) 仅能预防中枢卒中后疼痛的发生但不能翻转其维持...10
33.8 阻断 HIF-1α 可抑制 SDF1-CXCR4 信号分子的表达上调以及胶质细胞的激活..........105
4．讨论.......109
4.1 HIF-1α-SDF1-CXCR4 信号通路参与中枢卒中后疼痛的发生 ............ 111
4.2 SDF1-CXCR4 信号通路介导胶-胶和胶-神之间的正反馈并参与中枢卒中后疼痛的维持...........112
4．讨论
本实验中，我们证实丘脑内胶原酶注射引起 CPSP 的发生是由于丘脑出血早期损伤周边区域 HIF-1α 大量被激活进一步增加了神经元和胶质细胞内 SDF1 和CXCR4 的表达进而介导了小胶质细胞-星型胶质细胞-神经元之间的相互作用，而 CPSP 的维持则依赖于出血晚期 SDF1-CXCR4 信号介导胶质细胞-胶质细胞之间的正向反馈调节进而引起大量促炎因子 TNF ，L-1 和 IL-6 的表达释放。此外，在正常大鼠丘脑内注射 SDF1 通过 CXCR4 受体激活胶质细胞引起双侧机械痛敏进一步验证了SDF1-CXCR4信号参与CPSP的发生与维持。我们还发现HIF-1α 仅参与 CPSP 的诱导并不参与其维持过程。丘脑内注射 YC-1 可显著抑制胶原酶注射或氯化钴注射引起的机械性痛阈的下降。Fig.3-10 显示了 HIF-1α-SDF1-CXCR4 信号介导了小胶质细胞-星型胶质细胞-神经元之间的相互作用并进一步参与 CPSP 的发生与维持。
4.1 HIF-1α-SDF1-CXCR4 信号通路参与中枢卒中后疼痛的发生
HIF-1α 是低氧适应性反应过程中的关键转录因子 (Singh et al. 2012)。它是一个异质二聚体，由持续稳定表达的 HIF-1β 亚单位以及可调控表达的 HIF-1α 组成。低氧诱导因子的活性完全由其 HIF-1α 亚单位所决定。大量研究证明低氧状态下 HIF-1α 稳定表达并转移入细胞核与 HIF-1β 结合形成有活性的低氧诱导因子复合物，后者通过与 DNA 的相应位置结合从而介导下游靶基因的转录翻译(Zhang et al. 2011)。低氧是中枢神经系统诸多疾病病理改变的始动因素，尤其是脑卒中。本实验中，我们发现在大鼠丘脑内注射胶原酶诱导的脑出血性 CPSP 模型中 HIF-1α 在出血的早期表达明显上调，而在出血的晚期其表达水平与对照大鼠无明显不同。Jiang 等人的研究也支持我们的这一结果，他们发现在脑内注射自体血、凝血酶或溶解的红细胞同样可建立脑出血性卒中模型并发现在基底神经节内 HIF-1α 的表达亦明显增加 (Jiang et al. 2002)。此外，我们还发现抑制 HIF-1α 的上调仅能抑制 CPSP 的发生而对 CPSP 的维持无显著作用，提示 HIF-1α 介导了某一下游基因的激活但不参与到该基因的持续表达，且被 HIF-1α 激活的基因表达肯定参与到 CPSP 的维持过程中。丘脑内注射 HIF-1α 的特异性抑制剂 YC-1 能有效抑制丘脑出血周边区域 SDF1 和 CXCR4 的表达上调。事实上，有实验证实 SDF1 和 CXCR4 基因的启动子区域都含有低氧诱导因子的结合位点(Schioppa et al. 2003; Speth et al. 2014)。抑制体外培养小胶质细胞内 HIF-1α 的激活能明显减轻低氧环境引起的 CXCR4 上调以及 SDF1 依赖的小胶质细胞迁移(Wang et al. 2008)。在培养的皮层星型胶质细胞中，利用 YC-1 抑制 HIF-1α 明显抑制氧-糖剥夺引起的 SDF1 上调和释放 (Huang et al. 2014)。本实验中，我们发现无论是抑制HIF-1α亦或阻断SDF1-CXCR4信号通路均能抑制丘脑出血造成的损伤区小胶质细胞以及星型胶质细胞的激活，表明 HIF-1α 在 SDF1-CXCR4 信号的上调中发挥重要作用，并进一步引起了出血晚期小胶质细胞-星型胶质细胞-神经元之间的相互作用。为进一步明确 HIF-1α 的作用，我们在正常大鼠的丘脑 VPL核团注射了 HIF-1α 的诱导剂 CoCl2，发现丘脑部位的 SDF1 和 CXCR4 的表达显著增加且可被注射 YC-1 所抑制。此外，注射部位的小胶质细胞和星型胶质细胞也可被 CoCl2注射激活并能被 CXCR4 受体的阻断剂 AMD3100 所抑制，提示HIF-1α 参与了诱导 SDF1-CXCR4 信号介导的胶质细胞激活。Caltana 等人的结果也支持我们这一发现，他们证实将 CoCl2注射入大鼠额顶叶皮层能激活注射部位的小胶质细胞和星型胶质细胞 (Caltana et al. 2009)。最重要的是，本实验提供了新的有力证据证明正常大鼠丘脑内注射 CoCl2可通过激活 HIF-1α 引起短暂的双侧机械性痛敏。有研究报道 HIF-1α 参与外周神经病理性痛的发生，特异地敲除初级感觉神经元中的 HIF-1α 基因或者抑制坐骨神经中 HIF-1α 的积聚可抑制 SNI或 CCI 引起的神经病理性痛 (Hsiehetal.2012; Kanngiesseretal.2014)。然而，这两项研究并没有阐明 HIF-1α 是如何参与疼痛的调节。因此，本实验中所发现的HIF-1α 通过上调 SDF1-CXCR4 信号进而参与 CPSP 的发生可能对 CPSP 的临床治疗具有重要意义.
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小 结
疼痛是一种不愉快但又不可或缺的感觉体验。作为正常机体组织损伤的预警信号，疼痛使我们能够限制并避免伤害性刺激造成的进一步损伤，提供了必要的自我保护系统。这一类性质的疼痛持续时间都很短，被称作生理性疼痛或“好”痛。然而，不是所有的疼痛都有利于机体，大量的病人正遭受着病理性疼痛或“坏”痛的困扰。这类疼痛往往迁延不愈持续几周甚至几年，严重影响病人的日常生活，给个人及社会带来严重的经济负担。临床上，神经系统疾病或损伤引起的神经病理性痛和外周组织炎症引起的炎性痛是最常见的两类病理性疼痛。近年来，世界范围内围绕病理性疼痛的发病机制开展了大量的基础研究，取得了一些瞩目成绩。然而，目前临床上慢性病理性痛的有效治疗手段依然缺乏，药物镇痛效果依然有限。因此，进一步地深入研究病理性痛发病的细胞分子机制十分必要。大量研究证实神经或组织损伤过程中产生的炎性因子和趋化因子与疼痛的发生与维持密切相关，尤其是趋化因子 SDF1 及其受体 CXCR4 近年来逐渐成为疼痛研究领域的热点。为系统地阐述 SDF1-CXCR4 信号通路参与病理性痛发生与维持的具体机制，本课题采用 BV 模型，HP 模型以及 CPSP 模型分别从急性外周炎性痛，急性痛向慢性痛转变以及慢性中枢神经病理性痛三个层面开展研究。我们主要得到以下结论：
（1） BV 引起的外周炎性痛状态下，DRG 内 SDF1 及其受体 CXCR4 的蛋白表达显著上调并介导了卫星胶质细胞-初级伤害性神经元之间的相互作用形成了 DRG 内的局部炎性微环境，通过激活神经元内的 ERK 信号上调了 Nav1.8 通道的表达，最终引起初级伤害性神经元的兴奋和炎性痛的发生与维持。
（2） 外周 SDF1-CXCR4 信号通过激活细胞内下游的 ERK 和 PI3K-AKT 信号引起初级伤害性神经元内蛋白质的翻译表达，导致 HP 状态的形成，介导了急性痛向慢性痛的转变，并最终参与慢性炎性痛及慢性外周神经病理性痛的发生与维持。
（3） 丘脑出血状态下，出血损伤周边区域的 HIF-1α 被大量激活。作为转录因子，HIF-1α 促进了 SDF1-CXCR4 信号的上调，进一步介导了损伤周边区域小胶质细胞-星型胶质细胞-神经元之间的相互作用，引起神经炎症反应的加剧以及神经元兴奋性的增加，最终参与了 CPSP 的发生与维持。综上所述，本课题揭示了无论是外周病理性痛还是中枢病理性痛，无论是炎性病理性痛还是神经病理性痛，无论是急性痛还是慢性痛亦或是急性痛向慢性痛转变，SDF1-CXCR4信号通路均发挥着重要的调控机制，因此，针对SDF1-CXCR4信号通路在疼痛调控中的机制研究，或许能开发出新的镇痛药物或手段。
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参考文献（略）