前 言
目前大剂量放化疗仍然是治疗恶性肿瘤的重要手段。这些治疗方案虽能强力杀伤恶性肿瘤细胞，但也会对正常组织和器官产生毒副作用，尤其是对电离辐射和化学药物高度敏感的骨髓组织，由此导致造血干细胞（hematopoietic stemcell，HSC）耗竭和全血细胞减少，进而诱发严重感染、出血、贫血等并发症，增加治疗相关死亡率。文献报道，高达 50%的实体瘤患者和 80%以上的恶性血液病患者在治疗过程中会发生骨髓造血功能抑制，将近 10%的患者死于骨髓造血功能抑制引发的并发症。同时，造血恢复延迟直接导致治疗方案实施延迟或减量，影响放化疗方案的治疗效果，甚至导致无效治疗。造血恢复延迟导致患者不能接受标准的计划治疗方案，使患者治疗的相对剂量强度（实际剂量与计划剂量之比，relative dose intensity，RDI）大为降低，当 RDI 小于 85%会明显降低化疗疗效。事实上，RDI 小于 65%对接受化疗的患者几乎没有收益，特别是淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及卵巢癌等化疗敏感的肿瘤。大量研究证明，造血功能受损是影响化疗方案 RDI 最主要的因素。
对于放疗来说，目前全世界公认的辐射防护药物是美国研发的含硫类化合物衍生物 WR-2721，又名 Amifostine，国内商品名为氨磷汀，照射前半小时应用有效，但是因半衰期短、胃肠反应重等副作用限制了临床应用。后续美国波士顿大学研制的 EUK-400 被认为是最具治疗前景的新一代辐射保护剂，辐照前或者辐照后口服均有效，其长期疗效和副作用有待进一步观察。此外，针对放化疗所致的造血系统并发症，临床上以对症治疗为主，如血制品输注、细胞因子刺激等。此类治疗会引起一系列不良反应。首先，反复输注血制品不仅费用昂贵、机体容易产生抗体，而且输注本身具有一定风险，如过敏反应、感染其他传染病等。其次，临床应用最广泛的造血刺激因子，如 G-CSF（非格司亭、培非司亭）、GM-CSF（沙格司亭）、血小板生成素（thromobopoietin，TPO）、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、白介素-11（interleukin-11，IL-11）等，往往存在价格昂贵，起效相对缓慢，容易产生抗体等缺点。值得注意的是，在骨髓造血储备尤其造血干/祖细胞（hematopoieticstem/progenitor cell，HSPC）明显减少的条件下，再次给予 G-CSF 等细胞因子刺激造血干祖细胞增殖和分化，反而容易过度消耗 HSC，进而加重放化疗的残存损伤，导致骨髓耗竭。
上世纪六十年代，Thomas 教授首次成功完成了全世界第一例异基因造血干细胞移植，这一创新性研究彻底革新了血液肿瘤患者的治疗方案，为临床肿瘤治疗开创了新纪元。面对异基因配型难、同基因脐血干细胞数量低等难题，大量科研人员致力于 HSC 体外扩增领域。但是，由于体外培养条件的不可控性，难以模拟体内天然的骨髓微环境，HSC 体外扩增研究遭遇瓶颈。近年来崛起的体细胞基因重编程技术似乎为 HSC 扩增提供了新思路，然而，大部分转录因子在塑造 HSC 的同时，也能诱发白血病，一定程度上增加了癌变风险。还有部分学者致力于发展细胞治疗策略，这一方案同样依赖于 HSC 的归巢、自我更新和分化能力。因此，如何有效利用造血微环境中的基质细胞、细胞因子以及相关信号通路，寻找新的技术手段在体内促进HSC 扩增、归巢、干性维持，避免恶性转化，对于促进 HSC 植入、加快造血重建、提高患者生存率具有重要意义。
尽管如此，受机体复杂造血微环境影响，体内扩增 HSC 以及造血重建的相关研究进展缓慢。所幸的是，近年来对造血微环境的研究取得了长足进展，越来越多的治疗方向浮出水面。1978 年 Schofield 教授首次提出了干细胞龛（niche）的概念，越来越多的研究表明 niche 是体内容纳干细胞、调控其行为的细胞和细胞外基质微环境，它通过分泌各种造血生长因子、与 HSC 直接作用等方式，调节 HSC 在正常和应激造血环境下的存活、干性维持、增殖和分化，进而维持造血的动态平衡，参与的主要信号通路包括 Notch、Wnt、Hedgehog、BMP、HOXB4、Tie2、Bmi、PU.1、GATA 及 Myb 等。最新文献表明，除了传统意义上的骨内膜龛和血管龛，事实上造血龛内多种细胞类型均参与了 HSC 的调控，包括血管周细胞、窦状内皮细胞、巨噬细胞、CAR 细胞、交感神经和非髓鞘性施旺细胞等，其中小动脉窦状内皮细胞被认为是启动造血重建和再生的核心结构基础，在调控HSC 再生过程中发挥着关键作用。在结构上，骨髓窦状内皮细胞缺乏基底膜、薄壁，需要与周围造血细胞密切接触共同维持窦状血管的完整性。在功能上，骨髓窦状内皮细胞表达的粘附分子、配体及其基因表达谱也不同于其它器官的血管内皮细胞。在 HSC 龛中，窦状内皮细胞与HSC 关系密切。
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文献回顾
一、骨髓损伤与造血重建
1 正常造血
1.1 正常造血
在生理情况下，人体每天有大量造血细胞再生与衰老，造血稳态的维持依赖于HSC 的自我更新与多系分化，一系列细胞因子参与了造血的分级调控（图 1）HSC 是所有血液细胞的来源，主要定植在骨髓（bone marrow，BM）中，很少一部分（<0.1%）循环在外周血液里。1961 年 Till 和 McCulloch教授首次提出了造血干细胞的概念(1)，从此干细胞领域成为了生命科学研究的热点之一。造血干细胞是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞，能产生多种成熟细胞，其主要功能是维持造血稳态。半个多世纪的研究不仅揭示了不同谱系的造血等级分化以及细胞因子对造血的分级调控，而且发现了一系列抗原表面标志物以鉴定处于不同分化阶段的造血细胞（图 2）(2)，为研究造血及造血调控提供了良好平台。
造血干细胞的生命活动受自身表达因子（如信号分子、转录因子等）和周围环境（如细胞因子、粘附分子等）的精细调控。自胚胎末期，HSC 主要定居于骨髓造血微环境（造血龛，niche）中，其结构与功能的维持密切依赖于 niche。早在 1978年，Schofield 教授就提出了造血干细胞龛的概念(21)，目前普遍认为 niche 是体内容纳干细胞、调控其行为的细胞和细胞外基质微环境，它通过分泌各种造血生长因子、与 HSC 直接作用等方式，调控 HSC 在正常和应激造血状态下的存活、干性维持、增殖和分化，进而维持造血的动态平衡(22)。
骨髓窦状内皮细胞是构成 HSC 龛的主要支架细胞，有着不同于其它实质脏器血管内皮细胞的结构与功能。在结构上单层细胞的骨髓窦状内皮细胞位于血管表面，缺乏基底膜、薄壁，无紧密连接，被周细胞、动脉外膜网状细胞和 nestin+CAR 细胞覆盖，需要与周围造血细胞密切接触共同维持窦状血管的完整性。在功能上，骨髓窦状内皮细胞的基因表达谱及其所表达的配体和粘附分子也不同于其它器官血管内皮细胞，它是连接血液和骨髓组织的重要桥梁，对于造血损伤后 HSC 的维持和再生起着尤为重要的作用(17, 29)。研究显示，EC 和 HSC 共同起源于胚胎时期的多能造血干前体细胞（又名成血管细胞），但目前还没有证据表明 EC 能向血管周细胞分化(30, 31)。
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二、Notch 信号途径对造血调控的多样性
半个多世纪以来，科学家们发现许多信号通路均能维持 HSC 的自我更新，促进其扩增，它们包括 Notch、Wnt、Hedgehog、BMP、HOXB4、Tie2、Bmi、PU.1、GATA及 Myb 等。其中，高度保守的 Notch信号从胚胎发育到成年造血对维持 HSC 未分化状态、增殖、分化均起着重要调控作用，同时由于需要临近细胞 Notch 受体与配体的直接接触，在很多方面成为理想的连接 niche 与 HSC 的桥梁。
1. Notch 信号通路概述
1.1 Notch 信号通路的组成
Notch 基因最早于 1917 年由遗传学家 Morgan 发现，该基因的缺失将导致果蝇翅膀边缘缺刻（notches），因此将其命名为 Notch(167)。从线虫到人，各物种间的经典Notch 信号途径具有高度保守性，在细胞生长、分化及命运决定等方面发挥着重要作用。Notch 信号通路包含五种 Notch 配体（Jagged 1、Jagged 2、Delta-like 1、Delta-like3、Delta-like 4）和四种 Notch 受体（Notch1-4）（图 6）。配体胞外区由 DSL 基序和多个 EGF 样重复序列组成，主要发挥与受体结合的功能。受体胞外段则包含 3 个LIN 负性调控重复序列以及 33-36 个随机排列的 EGF 样重复序列；受体胞内段包含1 个 RAM 基序、1-2 个核定位信号（NLS）、多个锚蛋白（ANK）重复序列、1 个 PEST基序，以调节蛋白稳定性。Notch1 和 Notch2 含 TADs，Notch3 和 Notch4 则缺失该基序(76, 77)。Notch 受体合成后，蛋白转化酶会介导其 S1 位点发生切割，以促进Notch 激活后受体向胞膜运输；通过高尔基体时，Notch 受体会被糖基转移酶（如Fringe）糖基化，以决定 Notch 受体对不同 Notch 配体的反应(78, 79)。
1.2 Notch 信号通路的激活
Notch 信号通路的传导由一系列复杂分子事件组成（图 7），Notch 受体与配体相互作用后会触发分别由 ADAM10 非金属蛋白酶和 γ 分泌酶（GSI）介导的连续 2次蛋白剪切反应，导致 Notch胞内段（ICN）和胞外段（NECD）的释放。NECD 与信号发出细胞配体胞外段一起被内吞，Notch 受体的 ICN 则被释放入胞浆并转移到胞核(81)。在细胞核内，ICN 通过 RAM 结构域与转录因子 RBP-J 相互作用，取代辅阻遏物 SMRT 和 CtBP1 的位置，并招募辅激活物 MAML1 和乙酰转移酶 p300，从而激活 Hes 等靶基因的转录，发挥生物学功能(80, 82)。
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第四部分 Notch 信号与临床造血干细胞移植后造血重建的相关性研究...............128
1 材料 .................................................................... 128
1.1 实验仪器............................................................. 128
1.2 实验材料.............................................................. 128
1.2.1 临床样本.......................................................... 128
1.2.2 试剂.............................................................. 128
1.2.3 抗体................................................................ 128
1.2.4 引物 .............................................................. 128
1.2.5 主要缓冲液......................................................... 129
2 方法................................................................ 129
第四部分 Notch 信号与临床造血干细胞移植后造血重建的相关性研究
1 材料
1.1 实验仪器
仪器名称 公司名称
自动恒温摊烤烘片机 西安瑞丰仪器设备公司
1.2 实验材料
1.2.1 临床样本
经陕西省西安市第四军医大学第一附属医院和第二附属医院伦理委员会批准，选择血液内科层流移植病房 2013~2015 年间行异基因造血干细胞移植的患者入组，另设置健康对照人群，将其分为健康对照、预后好、预后不良、死亡四组，共 41 人，收集其清髓处理前、移植后 2 周、移植后 6 周外周血样各 2ml，所有样本获取均为患者知情同意。
1.2.2 试剂
所用试剂同前。
1.2.3 抗体
所用抗体同前。
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4 讨论
根据本课题前三部分的实验结论，结合 GEO 数据库中临床造血干细胞移植患者原始芯片数据的生物信息学分析结果，我们设想造血干细胞移植术后，患者体内Notch信号的激活水平与患者预后存在正相关性。经历近 2 年的临床样本收集及随访，首先，我们发现全部健康捐献人群血样和大部分骨髓移植患者移植前血样均存在Notch 下游入核活化片段 ICN1 的膜定位信号，提示生理稳态下 Notch 信号大多处于静息状态。其次，绝大多数移植成功且预后良好的患者在移植后第2周即出现了ICN1核定位信号强阳性，反之，预后较差的患者则表现出 ICN1 核定位信号弱阳性以及部分膜定位信号阳性共存现象，结合 Notch 信号下游靶基因的表达情况，从核酸和蛋白质水平论证了骨髓移植患者术后体内 Notch 信号活化程度与患者预后存在正相关性。再次，预后良好的移植患者出现了不同程度 Csf2rb 上调，但预后较差的移植者体内 Csf2rb 表达无明显改变，提示 CSF2RB 很可能是 Notch信号调控造血重建的下游靶分子。综上所述，本部分实验主要从临床样本角度映证了前期整体动物水平和细胞分子水平所发现的现象以及机制，为将 Notch 应用于患者早期预后评估提供了新的检测方法，更为术后利用 Notch 信号激活剂进行医疗干预提供了新的治疗靶点和治疗方向。
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小 结
本实验从整体动物、细胞以及分子水平着重研究了应激条件下 Notch 信号通路在体内对造血系统损伤再修复过程的调控作用以及机理机制，主要研究结论如下。
1、Notch 信号缺失不利于造血系统损伤再修复
将 Notch配体 Delta like 1 的 DSL 结构域和整合素分子 αVβ3 特异性配体 RGD相融合，表达出新型内皮细胞靶向的 Notch 信号激活剂——重组配体 mD1R 蛋白。在电离辐射以及化学药物诱导野生小鼠多种骨髓损伤模型中，证实 mD1R 具有体内激活 Notch 信号、挽救骨髓损伤、造血动员、促进髓内外造血重建、倾向性促进髓系造血快速恢复、扩增造血干祖细胞尤其长期造血干细胞、扩增的造血干细胞具有短期造血重建能力的生物学效应。
利用生物信息学技术筛选以及体内外实验证实，mD1R 激活 Notch信号途径后能显著上调 Csf2rb2 转录本和蛋白表达；报告基因和染色质免疫共沉淀实验从基因调控水平证实，Notch能识别并结合 Csf2rb2 启动子序列上的 RBP-J 结合位点，有效激活Csf2rb2 基因表达，进而活化 Notch 下游 STAT3/Erk 生存信号通路，这与 mD1R 抑制造血干祖细胞凋亡而不影响细胞增殖的细胞学机制相互映证。
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参考文献（略）