1. 前言
1.1 甘蔗生产中化肥的施用
一直以来，肥料利用效率低和肥料流失导致的环境污染问题是我国重点关注的课题之一。目前我国化肥施用主要以氮肥为主，磷钾肥为辅，中国氮肥工业的迅猛发展，导致氮肥的使用量一直居高不下，且预计今后仍然呈逐年递增趋势，而长期大量施用化肥会导致土壤中氮磷钾等营养元素的平衡失调。目前在世界上，禾本科作物的平均氮素利用效率仅为 33%左右，而在甘蔗生产中的氮肥投入就占其总投入约四分之一，我国甘蔗施氮水平约 500-700 千克每公顷，远超其他国家，是世界平均水平的两倍以上，更是在甘蔗生产大国巴西的十倍以上[1]。我国甘蔗生产中存在化肥施用量大、成本高、利用率低等问题[2]。据国内调查，从土壤中吸取氮素 1.5-2 千克才能生产一吨原料蔗[3]，为了甘蔗快速增产，大部分国家选择通过增施氮肥达到目标产量。但是随着 15N 同位素标记的应用，越来越多的国家明确认识到甘蔗产量并不会随施氮量的增加而不断增加，只有大概 30%-40%的氮肥施用量能被甘蔗吸收，未被甘蔗吸收利用的氮素有两种去向，其一是少部分被土壤微生物固定，其二是大部分都以淋洗、流失或挥发等方式成为了无效氮[4, 5]。在过去很长一段时间，我国南方蔗区施氮量成倍增加，但甘蔗的产量并没有明显提升[6]。土壤氮素损失的首要原因是淋溶损失，甘蔗是典型的热带、亚热带作物，这些地区降雨量大，土壤养分更易流失，有研究显示施氮量的不断提高会导致氮素在土壤中的残留量显著增加，尤其是土表十厘米以内的土层[7]，但在深耕培土栽培条件下，甘蔗根系分布较深，不利于对氮素的吸收利用。据报道，种植于毛里求斯的甘蔗，施用的氮素有 30%被有机化固定在土壤中，仅极少一部分能够被下一季甘蔗吸收利用[8]。氮肥的过量施用不但会提升甘蔗种植成本，还会造成环境的污染。所以，在确保甘蔗产量和经济效益的前提下，提高氮肥的吸收利用效率，降低氮肥施放量已经成为研究的重点和热点。
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1.2 植物内生固氮菌
自然界中具有生物固氮功能的微生物种类分布范围十分广泛，大致可以分成三种类型，分别为：共生固氮、自生固氮和联合固氮。其中联合固氮是指具有固氮能力的细菌与植物有着密切的联系，但是又不形成特异分化结构的共生关系，植物体内多种多样的固氮内生细菌与植物通常都是互惠互利的关系，属于联合固氮类型。联合固氮菌能与植物形成互生关系，具体表现在其既可以进行固氮作用，又可以产生植物激素促进植物生长[9]。
植物内生细菌是能与宿主植物建立互利共生关系的一类微生物，该类细菌能够定殖在细胞内部或者植物组织间隙。研究显示，部分内生细菌除了能够促进宿主植物的生根、发芽、开花和生物量累积等生长过程，还能产生具有生理活性的次级代谢物，或转化宿主中具有生理活性的成分来帮助宿主植物抵御病虫害、增强抗性。其中，内生固氮菌能够通过自身代谢固定空气中的氮元素，转化为氨后被植物吸收利用，是促进植株生长、提高作物产量的有效途径。因此，植物内生细菌的分离、鉴定及其应用对降低作物氮肥施用量、维护土壤环境友好具有重要意义[10-12]。固氮内生细菌可分为兼性和专性两种。兼性固氮内生细菌是指在根内外和土壤中的生活状态都相对活跃的内生菌，而后者一般仅定殖于根、茎、叶的内部，较难生存在土壤中。植物内生固氮菌是内生菌中的一种，指定殖在植物体内，并与宿主进行联合固氮的一类微生物，既具有固氮作用，又具备促进植物生长、生物防治等多种作用[13]。内生固氮菌也可广泛生存在土壤中，能在常温常压下，发挥体内固氮酶的作用，把空气中的氮气固定转化为氨，从而进一步变成植物可以吸收利用的氮素，对农作物增产起着至关重要的作用。固氮菌促进植物生长的方式有两种，一是固定空气中的氮，二是可以分泌各种植物生长激素类物质。有关研究表明，自生固氮菌的利用是提高多种粮食作物产量的有效途径[14-16]。因此，可以把它作为提高植物获得氮素的主要生物途径，最终实现减少农作物氮肥使用、减少环境污染、保护农业生态的农业生产目标。
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2. 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试菌株
本试验使用的 4 个菌株为课题组前期分离保存，它们具有固氮作用，且促进甘蔗生长，能在甘蔗体内有效定殖，PAL5 菌株由广西农科院甘蔗遗传改良重点实验室惠赠。试验中所用菌株信息如表 2-1。
农业论文参考
液培土壤取自广西大学甘蔗研究所多年种植甘蔗的蔗地，并进行高温灭菌。供试土壤理化性质如下：pH 值 6.7、全氮 0.82 g/kg、全磷 0.90 g/kg、全钾 7.10 g/kg、硝态氮17.11 mg/kg、氨态氮 1.82 mg/kg、水解氮 47.7 mg/kg、有效磷 22.0 mg/kg、无机磷 573.21mg/kg、速效钾 47.0 mg/kg、缓效钾 130.61 mg/kg。
桶栽试验土壤为广西大学甘蔗研究所内的大田土壤，理化性质如下：pH 值 6.8、全氮 1.65 g/kg、全磷 0.88 g/kg、全钾 18 g/kg，硝态氮 1.58 mg/kg、氨态氮 2.7 mg/kg、水解氮 109 mg/kg、有效磷 22.0 mg/kg、无机磷 223 mg/kg、速效钾 183 mg/kg、缓效钾 232mg/kg。称量土壤 15 kg 进行高温灭菌处理，冷却后装入桶中待用。桶规格为：上下口径约 24 cm，高度约 30 cm。
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2.2 试验设计
2.2.1 供试菌株组合
对 CA1、CN11、DX120E 与 WZS021 四个菌株分别编号并进行单独、两两、三三组合(表 2-3)，接种于土壤后测定土壤养分含量，即测定氮、磷、钾、有机酸等相关指标，以 PAL5 作为对照参考。
2.2.2 桶栽试验
桶栽试验菌株处理为筛选出的三个优质菌株组合以及 PAL5 菌株。具体接菌处理为：PAL5、DX120E、CN11+DX120E 和 CA1+DX120E+WZS021 共 4 个处理。对这 4 个处理编号(表 2-4)，分别接种于两个甘蔗品种，每个处理三个重复，每桶两株，分别于接种后 30 d、60 d、90 d 进行生理指标的测定，包括株高、茎径、叶绿素含量、地上地下部分干物质积累量，并取+1 叶片测定可溶性糖、硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)等酶活性。
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3. 结果与分析............................................ 14
3.1 最优促生菌株组合的筛选........................................... 14
3.1.1 不同接菌处理对土壤氮素的影响...............................................14
3.1.2 不同处理对土壤磷素的影响.......................................15
4. 讨论与结论........................................... 43
4.1 讨论............................................... 43
4.1.1 接种固氮菌对甘蔗的生长和代谢相关酶活的影响...................................43
4.1.2 接种固氮菌对甘蔗土壤养分和土壤酶活的影响......................................44
3. 结果与分析
3.1 较优促生菌株组合的筛选
3.1.1 不同接菌处理对土壤氮素的影响
土壤在接种组合菌液后，土壤中硝态氮、铵态氮、水解氮含量均有不同程度的增加，且都与空白对照差异性显著，但不同处理对土壤氮素含量影响不同，具有明显差异性(表3-1)。菌株组合 CN11+DX120E 处理后土壤硝态氮含量最高(达到 26.33 mg/kg)，比对照高 53.89%；菌株组合 CA1+DX120E 处理后土壤铵态氮含量最高(达到 9.62 mg/kg)，是对照的 5.29 倍；菌株 PAL5 处理土壤的水解氮含量最高(达到 85.10 mg/kg)，比对照高78.37%。可见，菌株处理提高了土壤氮素营养。
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4. 讨论与结论
4.1 讨论
4.1.1 接种固氮菌对甘蔗的生长和代谢相关酶活的影响
大量研究结果表明，内生固氮菌在植物的生长发育过程中具有促进作用[106, 107]。常慧萍[108]等从小麦根际土中分离纯化得到内生固氮菌株，证明其能显著促进小麦植株生长以及根系发育。李静等[109]在筛选植物根际内生菌后，通过盆栽实验证实其能促进黄瓜的生长。顾彩彩[110]发现内生固氮菌 DX120E 能在不同甘蔗品种中有效定殖，并显著促进甘蔗的生长。内生固氮菌也能显著提高甘蔗株高、生物量等生长指标。史国英[111]等研究发现盆栽接种菌株 NN08200 能显著提高甘蔗幼苗的株高和干重。罗霆等[23]研究发现，接菌处理促进了甘蔗生长，明显提高了甘蔗的株高、根长以及生物量。本研究结果表明，两个甘蔗品种，几个菌株接菌 90 d 后，与 CK 相比，各个接菌处理对甘蔗的株高、茎径、生物量均有促进作用，接种处理不同程度地促进甘蔗植株的生长，这与前人的研究结果吻合，但几个处理对两个甘蔗品种 B8 和 ROC22 的影响有一定差异性，这可能与甘蔗自身品种特性有关。此外，DX120E 与 PAL5 处理显著增加了两个甘蔗品种地上及地下部分生物量，同时这两个菌株接种后土壤中有效养分含量也明显提高，这是否是由于这两个菌株处理提高了土壤养分的含量，进而提高了甘蔗生物量，还有待进一步验证。
氮素是植物体内不可或缺的大量元素，作物体内的氮素含量和叶绿素含量呈显著正相关关系，提高氮素水平有利于叶绿素含量的增加[112]，从而促进光合作用来提高作物产量。硝酸还原酶(NR)是植物氮代谢途径中至关重要的酶，其活性高低是评价无机氮利用率的关键指标，对植物的氮代谢具有举足轻重的意义。谷氨酰胺合成酶(GS)在植物的氮循环中发挥重要作用，影响其氮素转化能力[113]。毛莲英[28]等将固氮菌 XD20 接种至3 个品种甘蔗，发现甘蔗的株高、生物积累量、叶片叶绿素含量以及 NR 和 GS 活性得到不同程度的提高，而刘鲁峰[114]等研究也发现内生枯草芽孢杆菌 B9 菌株处理的甘蔗组培苗的株高、根系长度、叶绿素含量、GS 活性均于对照，且处理的甘蔗的株高、蔗茎产量、茎径和蔗糖分均有所增加[115]。本试验结果表明，接菌处理提高了土壤中的氮素含量，同时能够在一定程度上提高甘蔗叶片中的叶绿素含量以及 NR、GS 活性，说明接菌处理促进了甘蔗光合产物的形成，表现为接种处理的生物量要高于对照，同时促进了甘蔗的氮代谢，甘蔗氮素水平有一定程度的提高，这与前人研究结果[116, 117]相吻合。硝酸还原酶活性的提高有利于甘蔗将 NO3-还原成 NH4+，而 NH4+的增加可以促进谷氨酰胺合成酶对 NH4+的同化，从而促进甘蔗的氮代谢。
参考文献（略）