第一章 文献综述
1 小黑麦研究进展
1.1 小黑麦概述
小黑麦（×Triticale wittmack）是由小麦属（Triticum）和黑麦属（Secale）经属间有性杂交和染色体数加倍而人工培育的一种异源多倍体新物种，于 1935 年被正式命名为“小黑麦”[1]。其远缘杂交优势明显，植株高大，生长过程中具有株高优势，抗逆性、抗病性强，籽粒营养丰富，秸秆的粗蛋白含量也较高，在利用过程中可收获籽粒和优质青饲料，还能在酿酒业和开发生物能源方面进行有效利用，是一种优良的禾本科牧草，被畜牧业发达国家和地区广泛种植与利用[2]，很大程度上解决了多个地区饲粮短缺问题。
小黑麦能够很好的利用冬春光热资源，在不同气候和环境条件下均适宜种植[3]。小黑麦以其种植成本低、高产耐寒的优良特性渐渐作为畜牧业发展新型饲料和再生资源作物，在饲草产业利用和生态文明建设进程中展现出较高的利用价值[2]，在中国西部大开发战略和农业结构调整中具有很好的发展优势[4]，受到人们越来越多的关注。开发利用好小黑麦这一牧草资源，能够推动协调种植业和畜牧业可持续发展，优化农业产业结构等方面具有极其重要的推动作用[5]。
1.2 小黑麦传统育种研究进展
目前小黑麦研究主要集中在籽粒产量和营养品质、品种选育、禾豆混播比例、生产性能、饲草营养品质、抗性和适应性等方面。杨小辉[6]通过对施用不同的氮肥类型和用量研究了饲用型小黑麦各收获时期的饲草产量、品质及再生性能的变化。杨军丽等[7]分别将 5 份六倍体小黑麦与二倍体冬黑麦进行远缘杂交，对田间杂交结果及杂交子代抗寒农艺性状进行了调查以及细胞遗传分析，筛选出可以适宜黑龙江省等地区高寒天气并顺利越冬的小黑麦冬性种质资源。裴亚斌[8]研究了秋播小黑麦与不同作物复种时产生的耦合效应对于作物在产量和营养品质以及土壤质量等方面的影响。王东霞等[9]研究了 3 个自育小黑麦品系分布在青海省不同海拔高度区域以及不同播种时间下的生产性能，为青海农牧交错区高效种植小黑麦研究工作提供了理论依据。王兆凤等[10]对 5 个小黑麦品种在非盐碱地和盐碱地的发育阶段、秸秆产量和营养品质进行了分析，分别筛选出适宜在 2 个地区栽植的小黑麦品种。Góral 等[11]通过在 2 个地点对 15 个冬小黑麦和 3 个冬小麦品系抗赤霉病性的 3 年评价试验，鉴定出低感染与低毒素污染相结合的小黑麦品系。代寒凌等[12]研究表明，小黑麦 C35 品系在甘南高寒牧区具有明显的区域适应性，且生物量和营养品质均显著高于对照，可以在该地区推广种植。姬亚红等[13]观测了三种麦草返青之后在不同时期的农艺性状并对若干营养指标进行了测定，采用灰色关联度法综合分析，结果表明小黑麦返青之后的灌浆期可作为首选青饲料补充家畜营养。任昱鑫等[14]研究表明，在蜡熟期刈割时草产量最高，在乳熟期刈割时营养价值和青贮品质有较好的表现。赵方媛等[15]综合评价了 18 份小黑麦新品系苗期的抗旱性能以及各品系对应的籽粒产量及营养价值、秸秆产量及营养价值，获得了适宜种植于甘肃省中部地区且高产优质的小黑麦新品系。王伟强等[16]研究表明，具备水热条件好且海拔较低的地方更适宜于推广种植小黑麦品种甘农 4 号。T.A.Aseeva 等[17]研究表明 Skoryi、Ulyana 和 Victoria3 个小黑麦品种对逆境因子表现出较好的抗性。
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2 分子标记技术及其在小黑麦中的应用
2.1 DNA 分子标记
随着分子生物学的兴起和不断发展，使得人们以生物的表型研究遗传规律逐渐发展到基因层面，对基因的结构与功能进行研究。在此基础上越来越多的分子标记技术相继问世，在植物遗传、分子图谱以及基因定位等方面的研究起到重要作用，并且对数量遗传学的发展具有重要的推动作用[23]。
DNA 分子标记（DNA molecular markers），是指能够揭示出生物个体或不同种群之间全基因组中某些差异特征的 DNA 区域，其以生物大分子的多态性为基础，能够直接对 DNA 水平的遗传变异进行反映[24]。基于基因表达结果（表型）的遗传标记（如形态学标记、细胞学标记和生化标记）在实际应用中有很多的局限性，而分子标记与其相比具有多个优点：（1）变异数量极其丰富，标记多，分布广；（2）多数特有共显性的分子标记，有利于鉴别和筛选隐性性状；（3）生物体的不同生长时期和不同组织没有特异性差异，均可进行标记分析；（4）分子标记直接体现的是生物基因组的变异，不受环境影响；（5）表现为中性，与不良性状不存在连锁，对目标性状的正常表达不会有影响；（6）检测手段高效快捷。目前广泛应用于构建分子图谱、基因定位、遗传多样性、物种亲缘关系鉴别等多方面的研究中；（7）部分分子标记在基因型开发和鉴定方面成本低廉，结果可靠，可重复性高[25,27]；（8）试验结果有利于在实验室内或不同实验室间互相交流且具有较好的重复性[28]。
目前还没有一种能够同时具备以上特点的理想分子标记，所以在研究中应综合考虑研究目的、研究内容、试验条件以及试验成本等多方面选择较为合适的分子标记。
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第二章 小黑麦饲草产量相关性状表型分析
1 材料与方法
1.1 试验地概况
本试验在甘肃农业大学牧草试验站进行。该试验站位于兰州市西北角，地处黄土高原西端，东经 105°41′，北纬 34°05′，海拔 1 525 m，属北温带半干旱大陆性半季风气候，年平均气温 11.2℃，年均降水量 327 mm，全年日照时数平均 2 446 h，全年无霜期 180 d 左右。区内地势平坦，肥力均匀，土壤为黄绵土，黄土层较薄，土壤有机质 2.27 g•kg-1，碱解氮 90.03 mg•kg-1，速效磷 7.29 mg•kg-1，速效钾 171.3 mg•kg-1，pH 7.30，有灌溉条件。
1.2 试验材料
本试验以小黑麦品种‘甘农 7 号’为父本、‘石大 1 号’为母本进行有性杂交获得的 F6代 RIL 群体（共 273 个单株）为试验材料。其中‘甘农 7 号’小黑麦为甘肃农业大学经有性杂交技术和系谱法选育而成的基因纯合且稳定性较好的小黑麦品种，‘石大 1 号’为新疆石河子大学将冬性小黑麦材料经过连续单株选育而成的小黑麦品种。
1.3 试验设计
试验材料种植于牧草试验站，将 F6 代 RIL 群体 273 个单株种子进行点播，20 cm 行宽，15 cm 株距，1 ~ 2 cm 的播种深度，水肥管理与田间管理水平相同。成熟期进行饲草产量相关性状的测定。
1.4 测定指标
成熟期对 273 个单株的株高、分蘖数、旗叶长、旗叶宽、穗下节间长和单株鲜重进行测定，测定方法如下： 株高：测量从地面至主穗顶部的高度（芒长不包括在内）。 分蘖数：株高高于 10 cm 的枝条数量。 旗叶长：旗叶叶片叶耳至叶尖的距离。 旗叶宽：旗叶叶片最宽处的宽度。 穗下节间长：主穗穗基部至穗下第一节间的长度。 单株鲜量：齐地面将整个单株刈割称其生物量。
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2 结果与分析
2.1 RIL 群体饲草产量相关性状的表型变异分析
由小黑麦 RIL 群体饲草产量相关性状表型分析结果（表 2-1）可知，RIL 群体平均株高为121.38 cm， 最高为 172.76 cm， 最低为 65.74 cm；平均分蘖数为 7.42 个，最多为 17 个，最少为 1 个；平均旗叶长为 19.46 cm，最长为 21.22 cm，最短为 6.75 cm；平均旗叶宽为 1.45 cm，最宽为 1.96 cm，最窄为 0.62 cm；平均穗下节间长为 42.18 cm，最长为 78.15 cm，最短为 15.48 cm；平均单株鲜重为 0.078 kg，最多为 0.370 kg，最少为 0.010 kg。此外，RIL 群体的饲草产量相关性状与两亲本进行分析比较时，结果表明 RIL 群体饲草产量相关性状的表型分布范围均超出了亲本表型分布，展现出超亲的遗传特点。其中单株鲜重的变异系数最大 (64.10%)，其次是分蘖数 (45.05%) 、穗下节间长 (34.29%) 和株高 (14.85%)，最后是旗叶长(10.59%)和旗叶宽(9.68%)，旗叶宽变异系数最小。从饲草产量相关性状的变异系数来看，旗叶长和旗叶宽的变异系数较小，能够稳定遗传；株高、分蘖数、穗下节间长和单株鲜重的变异系数较大，表明在选育小黑麦这几个饲草产量相关性状的过程中受到种植环境影响较大，可通过性状改良和改善栽培管理措施以达到预期结果。
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第三章 小黑麦饲草产量相关性状 QTL 定位 ..................................... 20
1 材料与方法 ................................................ 21
1.1 试验材料 ........................................ 21
1.2 小黑麦 RIL 群体的表型鉴定 .................................... 21
1.3 数据统计与分析...................................... 21
第四章 结论与展望 ....................................... 32
1 结论........................................ 32
2 展望............................................ 32
3 讨论
3.1 本研究材料的应用价值
本研究中小黑麦杂交亲本‘甘农 7 号’和‘石大 1 号’在饲草产量性状上具有较大差异，其中‘石大 1 号’株高高、分蘖数较多，虽然在饲草单产上具有优势，但在实际生产中可能发生倒伏现象，单位面积的产量除了和种植密度有关外，还与单株生物量紧密联系，‘甘农7 号’株高较低，两者杂交后如果可以使子代株高有所降低，减少由于倒伏而带来的产量损失。通过对 2 个小黑麦品种的杂交后代 F6 代 RIL 群体进行表型分析和分子标记辅助选择，选择株高适中，分蘖数及单株生物量较高的植株是可能的。而且 RIL 群体属于自交高代作图群体，基因型比较纯合，同样适用于一些不能够鉴别纯合子、杂合子的分子标记，具有较高的分辨率，在分子标记辅助育种中发挥着重要作用。
DNA 是遗传信息的载体，在分子标记中，一定数量和高质量的 DNA 模板会直接影响后续 PCR 扩增结果，因此获得量多质优的 DNA 是非常必要的。不同的 DNA 提取方法所提取DNA 的数量和质量也不一样。改良 CTAB 法在很多植物提取研究基因组 DNA 均有应用，能够提取出得率、质量均较高的 DNA 样品，ISSR 分子标记对于 DNA 样品的用量和质量要求较低，所以改良 CTAB 法可以满足试验要求。近年来试剂盒法逐渐普及，以其操作简单、耗时短、提取的 DNA 质量高等优点得到应用，可以满足对于 DNA 样品有较高要求的分子标记技术，但样品数较多时成本很高，不利于在一般实验室实施。在遗传研究中，应综合考虑所需要的样品数和分子标记等方面对于 DNA 样品的要求去选择合适的 DNA 提取方法，确保能达到一定的研究目的。
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第四章 结论与展望
1 结论
本研究以饲用型小黑麦 F6 代 RIL 群体的 273 个单株为试验材料，测定了株高、分蘖数、旗叶宽、旗叶宽、穗下节间长和单株鲜重的田间表型值，对小黑麦饲草产量相关性状的表型进行分析，探讨了各性状间的关联关系，并结合课题组构建的小黑麦 RIL 群体分子图谱，开展了饲草产量相关性状的 QTL 定位，为小黑麦遗传改良提供了研究基础支持。主要结论如下：
（1）RIL 群体中单株鲜重的变异系数最大(64.10%)，其次为分蘖数(45.05%)、穗下节间长(34.29%)和株高(14.85%)，旗叶长和旗叶宽的变异系数较小，分别为 10.59%和 9.68%，RIL 群体产量性状的表型分布均表现出超亲的遗传特点；小黑麦单株鲜重与饲草产量相关指标的相关系数由小到大依次为：穗下节间长<旗叶长<株高<旗叶宽<分蘖数，各性状指标间也存在比较复杂的相关关系，株高、穗下节间长均与分蘖数呈极显著负相关关系（P<0.01），穗下节间长与株高表现为极显著正相关性（P<0.01），穗下节间长与旗叶宽为极显著负相关性（P<0.01）；主成分分析可将饲草产量相关性状综合为生物量构成因子和株高构成因子，累积贡献率达 70.81%，基本可以反映小黑麦饲草产量性状的全面信息。
(2）RIL 群体各性状表型值呈连续变异，峰度、偏度绝对值均<1，分布频率变异呈连续性，符合正态分布和分离群体受数量性状控制的特点，该群体可用于 QTL 分析；以课题组构建的小黑麦 RIL 群体分子图谱为基础，结合表型遗传变异系数较大的草产量相关性状（株高、分蘖数、穗下节间长和单株鲜重）表型值，利用 MapQTL 6.0 作图软件对各相关性状进行 QTL 分析，在 7 个连锁群上共检测出 16 个饲草产量性状相关 QTL 位点，单个连锁群平均分布 QTL 位点 2.3 个。7 个连锁群上 QTL 位点个数不一，LG5 和 LG6 上均检测到 3个，是 QTL 位点最多的连锁群，LG4 上只检测到 1 个，是 QTL 位点分布最少的连锁群；其中检测到 5 个与株高相关的 QTL，4 个与分蘖数相关的 QTL，3 个与穗下节间长相关的QTL，4 个与单株鲜重相关的 QTL。
参考文献（略）