第一章 文献综述
1.1 肌肉组织中脂肪含量的研究
1.1.1 肌内脂肪沉积与猪肉品质
2015 年以来，我国肉类年产量达到 8500 万吨以上。猪肉是我国国民主要生产和消费的肉类，占畜禽肉总产量的 60%以上（国家统计局，2019）。长期以来，生产者对饲料转换率、瘦肉率、猪生长速度不断追求，而忽略了猪肉品质、风味的重要性。为保证我国养猪业的可持续发展，改善猪肉品质成了目前畜牧研究人员亟待解决的问题。猪肉品质主要通过猪肉的嫩度，pH 值，系水力，脂肪含量及风味等几个方面的指标来评判。在诸多因素中，肌肉脂肪含量对猪肉品质的评判尤为重要[1]。肌内脂肪是肉多汁性和风味形成的主要因素，在一定程度上增加肌内脂肪的含量可提升肉的口感[1]，这一点不仅仅在猪肉[2]上得到验证，在牛肉[3]，羊肉[4]上也有研究论证肌内脂肪增加可显著提高肉的品质。肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF）是由沉积在肌肉内的脂肪形成[5]，能够在肌肉的横切面形成大理石纹。肌肉中肌肉间质干细胞形成的成肌细胞和成脂细胞在相同的微环境中相互竞争，形成肌细胞和脂肪细胞。肌内脂肪包括成肌细胞中的脂肪沉积和成脂细胞形成的脂肪组织。肌内脂肪对肉品质的作用可分为以下 3 个方面：（1）IMF 与肉的嫩度相关。脂肪含量的增加能够疏松肌肉结缔组织，使肌肉纤维容易分离，从而改善肉的嫩度。豆成林[7]对比淮南猪与长白猪肌肉组织发现，淮南猪相比于长白猪有着更多肌内脂肪和较低的剪切力。（2）IMF 能够提高肉的多汁性。张宏博[8]研究发现，肌内脂肪含量与肌肉滴水损失成反比，在肌内脂肪含量高的情况下，肌肉的系水力更强。（3）IMF 能够使肉的风味更佳。脂肪是肉的风味的主要来源，通过热处理，脂肪中具有独特风味的脂溶性物质的挥发使肉的风味更佳[9]。目前，由于生产者关注瘦肉率忽略了 IMF 含量的重要性，使得猪肉中肌内脂肪的含量在 1%～1.5%之间，与高品质猪肉中肌内脂肪的的含量（2.5%～3%）相差较大[9]。因此，在现阶段维持猪肉的瘦肉率的同时提高 IMF的含量是畜牧业亟待解决的课题。鉴于肌肉组织中肌细胞的数量占绝大多数，肌细胞中的脂肪沉积对 IMF 的贡献也受到越来越多的关注。
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1.2 钙的研究进展
1.2.1 钙的理化特性
钙不仅是动物机体内含量最高的矿物元素，也是动物生命活动离不开的款物元素[24]，有着“生命元素”的美称。它在动物机体内的含量仅次于 C、H、O、N之后，是生命必需矿物元素。钙是一种二价金属元素，位居元素周期表中的第四周期，第二主族。原子序数为 20，符号 Ca。钙单质常温下为有光泽的银白色稍软的金属化学。性质活泼，微溶于醇，溶于酸、液氨，不溶于苯，在自然界多以钙离子（Ca2+)状态或化合物(氧化钙、氯化钙、氢氧化钙等）形式存在。人体中绝大部分的钙构成了骨骼和牙齿，少部分的钙以钙离子或钙结合蛋白的形式存在于血液和组织液中，在人体内发挥着重要的生理生化功能。
1.2.2 钙的生理功能
钙在动物体内主要分为骨钙和血钙，由甲状腺和甲状旁腺进行调节。它是动物体内不可或缺的元素。它在动物机体内主要表现形式为晶体和钙离子。它的主要生理功能如下所述：1.钙是构成动物机体的骨骼、牙齿的重要组分，这部分的钙对机体有着基础支撑，同时还可以协同肌肉完成机体日常运动。骨钙还是机体本身的钙库，通过成骨和溶骨的过程来维持机体内血钙的平衡。2.细胞外游离的钙离子在凝血过程中起到十分重要的作用，细胞外的钙离子通过激活凝血酶促使机体内可溶性纤维蛋白的转变成非可溶性纤维，从而帮助机体起到凝血作用[25]。3.细胞内游离的钙离子能够激活腺苷酸环化酶，糖原合成酶等多种机体日常代谢需要的酶类，对机体体内的生理生化活动起到至关重要的作用[26]。4.钙离子能促进乙酰胆碱的释放，调控神经元的兴奋性及调控肌肉神经的日常活动[27]。5.钙还能够调节细胞中酸碱度，维持细胞通透性的稳定[28]。除此之外，细胞内的钙离子还能调控机体炎症等[29]。钙在机体内发挥着广泛、重要的作用。当机体内钙缺失时，不仅会引起机体生理上钙的缺乏证，还会代谢失调，严重时更会抑制畜禽的生长及农副产品的产出[30]。一般来说，畜禽从天然饲料配制的日粮中获得的钙是不够的，需要额外添加磷酸氢钙，石粉，贝壳粉等钙源无机盐补充。
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第二章 材料和方法
2.1 试验仪器与试剂耗材
2.1.1 试验仪器设备
在本研究过程中主要的使用的仪器、设备如表 2-1-1 所示。
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2.2 饲喂试验动物及样品的采集
2.2.1 试验动物的饲养和试验日粮
本研究选取五月龄的健康状况良好，体重基本一致的三元杂交猪（长白 X大白 X 杜洛克）8 头，分别使用日粮中含 0.9%的钙（NC）和含 1.5%的钙（HC)在实验基地饲喂一个月（至 180 日龄）。分栏饲喂，每日定时饲喂两次，自由饮水采食，猪栏舍内的温度，湿度合适及其他生长环境适宜。
基础日粮由玉米、豆粕、麦麸、米皮、石粉配制。预混料由南宁艾格菲饲料有限公司生产。在日粮中添加石粉作为钙的补充。饲喂日粮的配方比及营养水平如表 2-2-1 A、B、C、D 所示。
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2.2.2 试验样品的采集
饲喂到 180 日龄时对两组猪同时进行屠宰，两组猪在同一时间段进行处死，解剖。在屠宰半小时内迅速测定其背膘厚、pH、肉色，系水力和剪切力。屠宰后，采集猪左半边胴体一部分背最长肌放入保鲜袋中，于冰盒保存。再迅速取背最长肌上的组织样，使用 PBS 溶液冲洗去除组织样表面附着物。为避免样品再次污染和 RNA 的降解，迅速将组织养分装到 2 mL 已灭菌的冻存管中，投入液氮中速冻。返回实验室后将肌肉组织样本保存于超低温（-80℃）冰箱中，以便于后续的实验研究。
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第三章 试验结果与分析...................................................23
3.1 日粮中添加钙对猪的肉质指标的影响.......................................23
3.2 添加钙培养 C2C12 细胞对甘油三脂水平影响..............................24
3.3 测序原始数据统计...........................................24
第四章 讨论......................................................56
4.1 钙对脂肪代谢的影响....................................................56
4.2 RNA-seq 和 RNC-seq................................................56
4.3 差异表达的 mRNA 与 RNC-mRNA 的富集分析...................................... 57
第五章 结论..................................59
第四章 讨论
4.1 钙对脂肪代谢的影响
本次活体试验上，使用了两种不同浓度的钙的日粮饲喂杂交猪。发现日粮中含钙（1.5%）较高的一组其背膘厚降低，肌内脂肪增加，肉色提高。在肌细胞试验中，C2C12 肌细胞分化晚期（72-96 h）时，添加含 3.33mmol/L 钙的培养基至分化完成。细胞内 TG 的含量相比于未添加钙培养的细胞来说，有明显上升趋势。而根据前人研究报道，在日粮中添加钙能够减轻动物体脂含量和抵抗由肥胖导致的疾病[78]，胞外浓度为 2.5 mmol/L 时，阻碍 3T3-L1 前脂肪细胞分化合成脂肪组织[79]。这与我们在活体试验上背膘厚降低的试验结果一致，在日粮中含 1.5%的钙对脂肪细胞中脂肪的沉积有抑制作用。Shi H 提出在脂肪细胞分化早期（0-1 h）添加钙，能够抑制脂肪组织的形成与脂肪细胞的分化，而在脂肪细胞分化晚期（48-72 h）添加钙，促进了脂肪组织的形成与脂肪细胞分化[80]。另一些研究表明，在日粮中添加钙能够改变肉类脂肪酸的组成，以及提高与脂肪合成有关的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和 CCAAT /增强子结合蛋白α（CEBPA）的 mRNA 水平[81]。 Zhang F 试验验证了猪骨髓间充质干细胞（pBMSCs）的培养基中补充钙能够增加其细胞内脂肪的生成和葡萄糖的摄取[82]。由此可见，钙对于不同细胞（或同种细胞的不同生长时期）在脂肪代谢上产生的影响并不一致，这也解释了我们的活体结果中，在日粮中含不同浓度的钙会导致背膘以及背最长肌中脂肪沉积的差异。
为了更好的找出这些差异，测序技术的出现为我们提供了有效的帮助。从基因到蛋白需要经过四个步骤的调控（mRNA 合成，RNA 的降解，蛋白的合成，蛋白的降解）。RNC-mRNA seq 检测的是正在翻译的 mRNA，它能够监测蛋白合成起始的调控。这对比于 mRNA 来说，RNC-mRNA 更贴近蛋白丰度表达变化。Xu[83]等通过 RNC-mRNA seq 检测到之前未成在其他测序上找到的基因。在本次测序中，基因在 RNC-mRNA seq 和 mRNA seq 的表达量的变化呈现出差异。RNC-mRNA seq 找出在 mRNA seq 上未发现的新的差异基因。对比差异 mRNA和差异 RNC-mRNA，RNC-mRNA seq 中出现了 59 个在 mRNA seq 中未找到的差异基因。这些差异基因中，有部分之前已被报道且试验验证了与脂肪沉积相关，如 PPIF 的缺乏能够导致线粒体功能障碍从而影响脂质的表达[84]，MdBazlur R Mollah 也鉴定出 GPD2 基因的表达能够影响小鼠脂肪沉积[85]。本次试验验证了不同浓度的钙对肌肉组织和 C2C12 肌细胞上 NCOR1 基因和 FABP3 基因转录水平上的表达。NCOR1 属于差异 RNC-mRNA，FABP3 基因既是差异 mRNA又是差异 RNC-mRNA。通过肌肉组织及 C2C12 肌细胞上 qPCR 验证，NCOR1的 mRNA 表达量在 HC 组和 NC 组中未呈现出显著差异，而 FABP3 的 mRNA 表达量在 HC 组中显著增加。与我们测序结果相符合。除其他组学分析外，RNC-seq可以从翻译水平对功能基因的筛选提供有效帮助。
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第五章 结论
(1) 日粮中含 1.5%的钙能显著降低背膘厚，提高肌肉脂肪含量，从而提高肉的品质。
(2) HC 组基因表达量在转录水平和翻译水平都显著低于 NC 组。日粮中含 1.5%钙抑制了整体基因的表达。
(3) 对在翻译水平上发现未在转录水平上发生变化的新的基因和通路，翻译调控从另一个角度对机制的研究和功能基因的筛选提供有效帮助。
(4) 在 PPAR 途径中，发现了在转录水平和翻译水平都存在显著差异的 FABP3基因和仅在翻译水平变化的 NCOR1 基因，RNC-seq 为钙调控肌肉脂肪代谢机制的研究提供了新的候选基因。
(5) 大部分基因翻译起始效率的变化与转录调控的变化方向相反，翻译调控对于转录调控有回调的作用。
参考文献（略）