1 前言
1.1 酱醪中微生物的分离鉴定
1.1.1 酱油的历史与现状
关于酱醪，早先的记录可以追溯到周代，至今已经有了三千多年的历史。有历史学家考证，我国为酱醪的发源地，周朝时期的酱醪主要是用肉制作而成的，腌制过程中产生的液体味道鲜美，被作为调味品流传下来。这是酱油的前身。“酱油”这个名称，最早是从宋朝开始的，制作原料开始从肉和鱼向大豆和小麦进行转变。在明朝的时候，酱油的生产趋于成熟并从福建开始传到日本，逐渐风靡东南亚和美洲。酱油这个名称就开始被广泛的使用[1]~[3]。
酿造酱油是以黄豆/豆粕和小麦/麸皮作为主要的原料。起初选用大豆作为蛋白质原料，但大豆中含有 20%的脂肪，不能被充分利用，因此会造成很大的浪费。现在主要以脱脂大豆为蛋白质原料，其中含有约 50%的粗蛋白和约 20%的淀粉类化合物。小麦中含有 70%的淀粉，10%~12%的蛋白质以及少量简单的糖类。因此脱脂大豆和小麦为酱油酿造提供了丰富的氮源和碳源。我国传统的酱油酿造主要有四个步骤：① 原材料的准备；② 利用米曲霉以及其他真菌物质将其混合进行制曲获得酶类；③ 将酱曲和盐水进行混合发酵；④ 酱汁的提取与混合。目前，在我国主要有低盐固态发酵和日式的高盐稀态发酵两种工艺。酱油风味南方北方差异明显。酱油市场分为四个部分：广东海天酱油为主的粤式酱油；上海家乐和淘大为主的外资酱油；北京金狮和天津天立等地区的地产酱油以及烟台欣和为主的日式酱油。我国酱油开始于传统天然晒露发酵生产，发展到现在是工业化控温生产，从单一菌株纯种发酵到多种菌株共同发酵，从天然晒露到现在的无盐、低盐等发酵[4]~[6]。
我国酱油发展中，大部分是低盐固态发酵，占生产总量的 85%，一般分为四个等级，它的色香味并不是很好，优点是价格低廉。
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1.2 酱油胀瓶原因探究
酱油胀瓶是令企业头疼的问题。酱油成品在进行灌装之前会进行“巴氏消毒法”消毒。一般能够去掉大部分有害菌，达到我国卫生质量标准。但是有时候仍然存活着少量的耐性细菌，这其中可能包含有产气的细菌难以消除。原因是在工厂中的生产环境欠缺，条件不好，空气中的微生物难以避免的侵染到曲和酱醪中。一方面防腐剂若不能够完全发挥作用，则会使环境空气中的一些非致病但耐热的细菌在成品酱油中生长繁殖；另一方面，现在很多客户要求酱油中不允许添加任何防腐剂，而且高档次的有机酱油也不允许添加防腐剂。这样酱油中的细菌在温度适宜的条件下能够繁殖生长，并且产生气体，从而造成了成品酱油的胀气现象[44]。
1.2.1 酱油腐败现象
成品酱油中，由于存在着一些细菌和其他菌类，在条件允许的情况下，酱油会有腐败现象，影响了酱油的风味、外观和颜色等。例如：① 酱油沉淀浑浊。② 酱油表面长霉花。③ 成品包装的酱油胀气。这种情况是由于酱油中的微生物主要是细菌生长繁殖和发酵产生了气体引起的，其发酵产物不仅破坏了酱油中的营养物质，改变了 pH，而且可能产生异味，造成了企业的巨大损失[45]~[46]。
1.2.2 酱油腐败原因分析和防范策略
据分析，酱油腐败的原因有很多：① 准备原料时候，处理方式不合理，分解不彻底，在进行后期处理的时候添加的水硬度大，导致酱油浑浊沉淀，所以在原料处理和后期加工时期要加强管理。② 酱醪中的原料是大豆小麦等，其中含有很多的蛋白质，在制作过程中需要控制含量，因为蛋白质含量过多会导致成品酱油中出现沉淀浑浊的情况。酱油的胀气现象分为三种化学反应：① 化学反应，酸和铁反应会胀气，被称作铁胀，也有酸碱作用产生气体。② 物理作用，主要由于热胀冷缩导致的酱油胀瓶的现象。在生产的过程中，采用低温灌装，在温度升高的时候，就会出现胀瓶，胀气现象。③ 生物作用，制作酱油的过程中残留细菌的生长繁殖。要初步解决这些问题可以采取一些简单的措施：① 提高生产环境的卫生，进行消毒和清洗，从而减少空气中的细菌，从而减少酱醪中的细菌。② 改善消毒的工艺。③ 改善成品酱油中的防腐剂的成分，从而抑制成品酱油中的微生物的生长。④ 使酱油中残留的非致病菌处于活的非培养态可能也是一种更有效的防腐方法[47]~[49]。
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2 酱醪中微生物的分离鉴定
2.1 试验材料和仪器
2.1.1 试验材料
酱油发酵过程分为前期、初期、中期及后期四个时期，每个时期起作用的微生物不同，产生的物质成分也不同。因此选取投料后 10 天的发酵酱醪（Ⅰ期），投料后 30 天的发酵酱醪（Ⅱ期），添加酵母液后 40 天的发酵酱醪（Ⅲ期），发酵周期为 5 个月的发酵酱醪（Ⅳ期）作为四个时期的试验样品。分别在 LB 培养基、MRS 培养基和豆芽葡萄糖培养基上分离纯化培养，根据得到的单菌株菌落再进行分析研究。
表 2.1 试验材料
表 2.2 试验试剂
2.2 试验方法
2.2.1酱醪中微生物的分离纯化
1） 倒平板：将配置好的 LB 培养基、MRS 培养基和豆芽葡萄糖培养基放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，待冷至 55~60 ℃时，分别倒平板。
2） 稀释：在无菌的条件下，将四个时期的酱醪分别取 10 mL，放于装有 90 mL 的无菌水的三角烧瓶（内含玻璃珠）中，震荡约 20 min，使酱醪与无菌水充分混合，制成稀释度为 10-1 的酱醪稀释液。再依次梯度稀释为 10-2，10-3，10-4。
3）涂布：用移液枪吸取 0.2 mL 的不同浓度的酱醪稀释液依次加入到先前已灭好菌的 LB 培养基、MRS 培养基和豆芽葡萄糖培养基（两个平板进行对比）的中间位置，用无菌涂棒在培养基的表面轻轻涂布均匀，室温下静置 5~10 min。
4） 培养：将 LB 培养基的平板倒置于 37 ℃的温箱中培养 24 h。MRS 培养基和豆芽汁葡萄糖培养基的平板倒置在 37 ℃的温箱中培养 48~72 h。
5） 观察：主要观察酱醪中细菌的菌落形态。将菌落形态不同的细菌进行记录。
6） 镜检：将记录下来的菌落用接种针挑取少许，用显微镜检查是否为单一细菌细胞。若发现其中有杂菌，则进一步分离纯化，直到获得纯培养。若为纯菌株，则将菌株的个体形态记录下来并进行斜面培养，标记后保存。
2.2.2酱醪中细菌的鉴定
2.2.2.1形态学特征
菌落形态：在之前的平板上观察菌落的特征：包括菌落的形态，大小，颜色，隆起，表面状况，质地等。
个体形态：挑取少许细菌进行简单染色和革兰氏染色，观察细胞的形状，排列，芽孢等。
简单染色：载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑起菌落涂抹 ，在室温干燥，通过火焰固定，滴加结晶紫染色 1 min，倒去染液用水冲洗，然后吹干后镜检观察。
革兰氏染色： 载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑起菌落按照简单染色进行初染，用水冲洗后加碘液冲去残水，覆盖 1 min，再次水洗后用滤纸吸水，用酒精流洗 30 s，直至无紫色再水洗，用番红复染 3 min，水洗干燥后镜检观察。
根据分离菌株的形态学特征，查阅《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定到大类，再根据细菌的特征针对性的进行生理生化实验。
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3 枯草芽孢杆菌的酶学特性研究........................................30
3.1 培养基的准备..............................................30
3.1.1 测蛋白酶用的培养基...........................................30
3.1.2 测淀粉酶用的培养基...........................................30
4 枯草芽孢杆菌的培养条件优化.................................41
4.1 实验方法................................................41
4.1.1 培养条件的单因素影响.......................................41
4.1.2 正交试验............................................41
5 结论与展望...........................47
4 枯草芽孢杆菌的培养条件优化
4.1 实验方法
4.1.1 培养条件的单因素影响
为确定枯草芽孢杆菌最适宜的培养条件，设计了培养条件的单因素影响实验。主要选取了五个因素进行实验：葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、pH、装液量、接种量。
操作：用 250 mL 锥形瓶，以装液量 100 mL、接种量 5%、pH 7.0 上述培养基为基础，依次改变葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、pH、装液量和接种量，进行培养；每个因素设五个梯度，每个梯度设三个平行样，取三个平行实验的平均值为测量结果。
表 4.1 单因素影响实验设计
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5 结论与展望
本论文主要以投料后 10 天的发酵酱醪（Ⅰ期），投料后 30 天的发酵酱醪（Ⅱ期），添加酵母液后 40 天的发酵酱醪（Ⅲ期），发酵周期为 5 个月的发酵酱醪（Ⅳ期）作为主要研究对象，分离鉴定出了四期酱醪中的微生物。其中Ⅰ期和Ⅱ期中的微生物以乳酸菌为主，乳酸菌影响着酱醪的成熟，乳酸菌能够降低酱醪的 pH,使得酱醪的 pH 从 6 降低到 5.6 左右，此时乳酸菌则不适宜生长开始死亡。乳酸菌能够增强酱油的香味，使得酱醪中曲霉的霉味消除，增强酱香味。乳酸菌能够促进酵母进行酒精发酵。
在四期的酱醪中，均有芽孢杆菌的存在，且占绝大多数。芽孢杆菌在酱醪中属于有益菌，但是若在成品酱油中仍然存在，则可能会引起酱油的胀气胀罐和腐败现象。在试验的过程中，分离出两个产气芽孢杆菌，分别为 H31 多粘芽孢杆菌和 H19梭状芽孢杆菌，这两类芽孢杆菌很可能是引起酱油胀气的源头。虽然只鉴定出 6 种细菌，并仅进行了 1 种益生菌的分子生物学鉴定，而其余 5 种未进行分子生物学的鉴定，来验证初步鉴定出的 5 种菌株，由于传统的鉴定方法具有主观性和人为偶然性，所以这 5 个菌株不够精确，需要用分子生物学的方法进一步验证会更准确。考虑到企业的生产和质检目的主要是提升产品质量和成品保质期等，初步鉴定的结果已经可以满足需要，因此未进行分子水平鉴定。
由于对酱醪进行稀释分离纯化的方法分离微生物，估计会有部分微生物由于含量较少而没有分离出来，还有可能存在活的非培养状态的微生物。为此，我们也用细菌通用引物按照试剂盒说明的方法，对酱醪处理后进行了 PCR 扩增实验，结果并不理想，没有出现明显的 DNA 条带。对于成品酱油中是否存在活的非培养状态的细菌及其作用，以及酱醪中可能存在的其他微生物，最好的检测工具应该是 PCR 技术。因此，以后应该进一步研究该技术在酱油产业的应用。
鉴于枯草芽孢杆菌有发酵酱油并赋予酱油特殊风味的潜力，未来在酱油酿造过程中添加一定量的枯草芽孢杆菌的深入研究，对酱油风味的提升带来新的思路。
参考文献（略）