1 绪论
1.1 干制水产品概述
1.1.1 干制水产品开发利用现状
随着经济的发展，我国现已成为世界第一渔业生产大国、水产品贸易大国和主要远洋渔业国家，在水产养殖等一些领域已经达到世界先进水平。同时，现代渔业产业体系初步建立，渔业科技支撑也不断增强，以“两带一区”为代表的优势水产品养殖区域布局基本形成，水产养殖产业也全面推进。
中国水生生物市场是世界上最大的市场，而且增长迅速，从上个世纪 90 年代，我国水产品的生产和消费量就稳居世界第一[1]，水产品年总产量占世界总产量的 30%左右[2]。而山东半岛是我国水产养殖业的主要地区，同时也是我国出口水产品的主要出产地[3]。山东半岛濒临渤海、黄海，海岸线全长约 1700 km，沿海滩涂面积约 500km2，海产资源丰富，海洋捕捞业以及海产品加工业发达。目前，各种海产品如鱼类、虾类、贝类等因其味道鲜美，营养丰富已经成为人们的日常消费品。然而，新鲜的海产品很容易腐烂，对运输条件要求较高，阻碍了产品的流通和水产行业的发展，因此通过一定的手段延长其货架期至关重要。目前，冷藏、冷冻、盐渍、罐装、烘干和熏制是最常用的有效保存技术[4]。比如鱼糜制品、罐头产品、盐渍水产品以及干制水产品等。其中，干制水产品比如烤鱼片、鱿鱼丝、海米、虾皮、小鱼干等由于其独特的风味和较长的保质期，在中国占一定比例，并在中国广泛消费[5]。
1.1.2 干制水产品有害污染物概述
近年来，干制水产品成为新鲜水产品深加工的标志性产业，在沿海城市中占据重要地位。随着渔业的快速发展和人们生活水平的提高，在注重水产品营养价值的同时，其安全性也越来越受到人们的广泛关注[6]。近几年发生的“多宝鱼事件”、“孔雀石绿事件”、“贝类毒素”、“藻类中的重金属问题”、“敌敌畏海参”、“烤鱼片中 N-二甲基亚硝胺超标”等问题[7]，都给我国水产养殖业造成巨大损失，因此开发安全快速的海产品质量检测控制技术，对于渔业产业的可持续发展具有重要意义。
水产品的质量安全问题日益突出，主要表现在以下几个方面：一是一些不良企业随意排放废水、废弃、废渣，有毒有害物质对海洋食品安全卫生造成严重隐患；二是在海产品养殖加工过程中为追求经济效益违规用药，从而影响海洋食品的食用安全；三是海洋食品中的生物毒素和有害微生物对消费者的身体健康和生命安全造成威胁；四是违规使用加工助剂和添加剂；五是水产品的特异性蓄积通过食物链进入人体内，带来安全隐患。因此建立安全快速检测方法对有害污染物进行检测是保障渔业产业可持续发展的迫切需求。
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1.2 水产品中有害污染物的前处理方法
样品前处理是整个分析方法最重要的组成部分，它对后续的分析结果有很大的影响，是对分析物进行明确识别和定量的前提。样品制备通常包括提取、净化和浓缩步骤，然后进行最终分析[13]。提取方法通常是从样品中分离出残留污染物，而净化方法的目的是分离共提取的基质成分，以获得更纯净的样品提取物[14]。对有毒有害物质的分析过程则在于消除干扰仪器测定的主要基质成分，如脂质、蛋白质、维生素等成分。
1.2.1 液液萃取
液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）是一种经典的样品前处理方法，目前仍广泛用于各种药物的检测。LLE 是一种基于分析物在两种互不相溶的液相（通常是水和有机溶剂）中的不同分布（相对溶解度）的分离过程，该过程受分配平衡控制。分析物的提取是从第一个液相转移到第二个液相，这是通过两相之间的溶解度差异来实现的[15]。乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等均可作为萃取溶剂。例如Kim 和 Shin[16]建立了一种 LLE 方法，用于从电子烟替代液中提取和纯化烟草特异性亚硝胺。在使用各种萃取溶剂（例如戊烷，甲基叔丁基醚，二氯甲烷和乙酸乙酯）评估丙二醇的效果后，将二氯甲烷用于简单的萃取过程，以实现更高的回收率。Desmarchelier 等人[17]建立了一种 LLE 前处理方法结合 LC-MS/MS 检测食品中 5 种四环素及其同分异构体的方法，用乙二胺四乙酸（EDTA）和乙腈进行液液萃取，然后进行冷冻步骤，以促进低温下的相分离，样品萃取物经正己烷脱脂后通过 LC-MS/MS法进行检测。尽管 LLE 在一些方面表现出优势，然而仍存在一些不可忽视的缺点，例如乳液的形成、较差的相分离、难以自动化以及使用剧毒的有机溶剂等，这会导致大量环境污染物的生成。
1.2.2 分散液液微萃取
分散液液微萃取（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）是基于一个由三个组分组成的溶剂系统：萃取溶剂、分散溶剂和样品溶液。原理图如图 1-1 所示，利用分散溶剂与其他两种溶剂的混溶性，萃取溶剂可以作为非常细小的液滴分散到水相中形成混浊溶液。离心后，用微量注射器将沉淀在锥形试管底部的萃取溶剂颗粒取出进行分析。与其他方法相比，由于分析物与细小液滴之间有足够的接触面积，大大加快了萃取过程，缩短了分析时间。Rodríguez 等人[18]将 UAE 与 DLLME 联用，从鸡蛋样品中分离出四环素，然后使用流动分析法进行分光光度法测定，LOD 为 6.4μg/L~11.1 μg/L，加标回收率为 85.7%~96.4%，RSD 小于 9.8%，结果令人满意。
图 1-1 DLLME 程序
2 基于 MWCNTs 快速滤过型净化方法结合 HPLC 检测干制水产品中的四环素类抗生素残留
2.1 前言
四环素（Tetracyclines，TCs）是一种天然或半合成的抗生素，对多种革兰氏阳性菌（葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌）和革兰氏阴性菌（淋球菌、霍乱、痢疾杆菌、布鲁氏菌）均表现出抗菌活性[13]，因此，广谱作用的四环素抗生素已经在世界范围内被广泛应用。四环素类化合物具有相似的化学结构，而且四环素还是很强的螯合剂，易与二价金属离子发生螯合作用，主要的螯合部位是 11，12B 双酮体系，最常用四环素及化学结构如图 2-1 所示[48]。
图 2-1 最常用四环素类药物的化学结构
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2.2 材料与方法
2.2.1 材料、试剂和仪器设备
市售干制水产品如烤鱼片、小鱼干、鱿鱼丝等，主要仪器设备和试剂分别列于表 2-2、表 2-3。
表 2-2 实验仪器
单标储备溶液的配制：用万分之一分析天平分别准确称取 TC、OTC 和 CTC 各50.0 mg 精确至 1.0 mg，置于 50 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，常温超声溶解，混匀，于-20 ℃冷藏避光保存。
混合标准工作溶液：分别量取 3 种药物单标储备溶液各 500 μL 于 50 mL 容量瓶中，稀释成 10 μg/mL 的混合标准储备液，然后再量取一定量的混合标准储备液，用甲醇稀释系列浓度的标准工作液，将该系列浓度标准溶液置于 4 ℃冰箱冷藏避光保存，现配现用。
0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液：将 1 L 0.1 mol/L 柠檬酸溶液与 625 mL0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液混匀，并加入 60.5 g Na2EDTA 溶解、混合均匀，用 H3PO4或 NaO H 调节 pH=4.0 左右。
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3 基于改良 QuEChERS 方法结合 GC-MS 检测干制水产品中的 9 种 N-亚硝胺........24
3.1 前言.......................................24
3.2 材料与方法..................................27
4 总结与展望.........................................40
3 基于改良 QuEChERS 方法结合 GC-MS 检测干制水产品中的 9 种 N-亚硝胺
3.1 前言
N-亚硝胺（N-nitrosamines，NAMS）是一种强致癌物作用的化合物[78]，这些化合物在食品中的存在已成为严峻的公共卫生问题，国际癌症研究机构（IARC）已将N-亚硝胺类化合物列为对人类最具致癌性的物质[19,79]，将 NDMA 和 NDEA 列为 2A类致癌物，此外超过 10 种挥发性和非挥发性亚硝胺被归类为 2B 类致癌物质。它们在鼠伤寒沙门氏菌的艾姆斯测验试验中显示出突变活性，并在大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠和兔子中引发致癌效应[80,81]。NAMS 是一组含有 R2N-NO 的有机化合物，最常见的 9 种挥发性 NAMS 以及化学式、分子式和分子量如表 3-1 所示。
表 3-1 9 种 N-亚硝胺的结构式、分子式和分子量
近年来食品安全日益受到重视。人类接触 N-亚硝胺类化合物的主要来源是食用各种食物，而在食物中，这些 NAMS 是由次胺与亚硝化剂（如硝酸盐或亚硝酸盐）反应形成的[82]。目前已经在各种样品中检测到 NAMS，例如水[83–85]、酱油[86,87]、肉制品(香肠[88–90]，培根[34]，烤肉[19])、腌制产品(泡菜[91]，咸鸭蛋[92]、干腌鱼[93,94])等样品。由于其抗菌特性，亚硝酸盐通常被用作食品防腐剂；因此，亚硝酸盐可以与肉质品中存在的仲胺反应生成 NAMS，从而增加患癌症的风险。除了人工添加，在烹饪过程中也可以形成 NAMS，例如通过烟熏、烘焙和油炸。此外在啤酒中也检测出NAMS[95,96]，啤酒中的亚硝酸盐主要是通过细菌还原天然存在于水中的硝酸盐而产生，胺的来源是大麦中存在的谷氨酰胺中的二甲胺。除了食物来源，NAMS 还可以存在于环境[97]和化妆品[98]中，甚至可以在人体内合成。
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4 总结与展望
本论文采用 QuEChERS 方法与 m-PFC 装置相结合，以灵敏度较高的 HPLC 和GC-MS 为检测手段，对干制水产品中的四环素类抗生素残留和 N-亚硝胺进行检测。通过改进 QuEChERS 方法，优化萃取条件与吸附条件，对方法学进行验证，成功应用到干制水产品的检测中。
1、建立一种以 MWCNTs 复合材料为吸附剂的 m-PFC 净化装置，采用 QuEChERS方法结合 HPLC 对干制水产品中的四环素类抗生素残留进行检测，通过色谱条件的优化，使目标物获得有效的分离，此外优化了萃取条件，吸附剂材料和净化程序等参数，最终选取 0.1 mol/L 的 Na2EDTA-Mcllvaine 和 0.1%甲酸乙腈作为萃取剂，NaC l和 Na2SO4 作为盐析材料，C18、MgSO4 和 MWCNTs 作为吸附剂进行净化。经方法学验证，3 种四环素类抗生素在相应的浓度范围内线性良好，相关系数大于 0.9989，LOQ 在 15~23 μg/kg 范围内，在 50、100、200 µg/kg 三个不同浓度加标水平下，整体回收率良好，RSD 为 1.6%～10.6%，可用于实际样品的检测。
2、基于改良 QuEChERS 方法结合气相色谱质谱联用，建立了干制水产品中 9种 N-亚硝胺的检测。通过优化色谱、质谱条件参数，使得 9 种 NAMS 得到有效的分离，对 QuEChERS 方法进行改进，优化了萃取条件与吸附条件，获得最佳的前处理方法，最终选取乙腈为萃取溶剂，PSA、MgSO4、C18 和 MWCNTs 复合材料为吸附剂。结果显示 9 种 NAMS 在相应浓度范围内线性良好，相关系数为 0.9918～0.9999，LOD 和 LOQ 分别为 0.11~0.96 μg/kg 和 0.36~3.18 μg/kg，除部分化合物之外，整体回收率在可接受范围内，RSD 在 0.2%～19.1%范围内。此外还比较了烤鱼片、鱿鱼丝、小鱼干和虾米四种不同样品之间的回收率，发现在不同基质中的回收率无明显差异，可用于干制水产品中 NAMS 的检测。此外分析了近三年干制水产品中 NDMA 超标的主要因素，为干制水产品中 NDMA 的限量标准提供参考依据。
参考文献（略）