第一章 绪论
1.1 海参概述
1.1.1 海参简介
海参（Stichopus Japonicus）属于海参纲棘皮动物门，是一种海洋无脊椎动物，从生物进化角度看，与海星、海胆和海百合有关[1]。海参是一种具有多种生物活性的营养和功能性食品，数世纪以来一直受到人们的重视。海参本身就具有很多营养物质，包括海参多糖、海参皂苷、海参多肽、维生素、脂类等。海参既是一种珍贵的海洋食品，也是重要的药材来源，具有很高的食用和药用价值，其具有多种生物活性如清除体内氧化自由基、抑制体内脂肪堆积、抑制肿瘤细胞活性等[2]。海参多分布于热带、温带区域，有 1200 多种，大多数分布于亚洲近太平洋地区，其中我国有 100 多种，在我国可食用的海参约有 20 余种，并且据报道，黄海和渤海区域的海参由于其得天独厚的条件，营养价值更高[3]，海参作为中国的传统补品，是一种标志性的高蛋白、低脂肪的食物早在魏蜀吴时期就有食用海参的记载，到清代后期，海参更是被抬上升到“八珍”之首的地位[4]。
1.1.2 海参的加工利用现状
伴随经济的不断发展，消费者对海参有越来越大的需求。现阶段全球可养殖或捕捞海参品种超过 66 种，2008 年，全球有超过 2 万吨的干海参产量，海参产业遍布 70 多个国家，截止 2018 年，全球干海参总产量约达 3.93 万吨，其中我国干海参的产量约为 4379 吨[4]。2017 年国内当年海参养殖产量总体规模近 20万吨，其中山东省产量连续保持第一，约收获 9.7 万吨，2019 年下半年始受疫情影响，海参消费减少，价格未有太大涨幅，但是山东省地区外塘海参 1~6 头/500 g 规格的消费水平仍然保持着全国领先[5]。海参作为一种高档水产，主要消费场所多为酒店宴席，通常捕捞或人工养殖的海参经过加工后制成干制品出售于市场，海参根据加工方式的不同产品的分类也不同，有盐渍型、糖干型、淡干型等。随着科技和行业的进步，海参深加工产品的种类也逐渐增多，如海参丸、海参口服液、海参肽和海参保健酒等[6]。
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1.2 海参内脏的主要成分
1.2.1 海参蛋白及氨基酸
研究表明蛋白质是海参内脏重要的营养部分[4]，这种特性使得海参内脏富含大自然界中常见的各类氨基酸，其中含量最多的结合氨基酸为谷氨酸；人类所必需的氨基酸在海参内脏所有的氨基酸总量里占比也很大，其中最多的为赖氨酸，并且其在海参内脏中的含量要比体壁中的含量多[8]。除此之外，海参内脏中占干重比例一半以上的粗蛋白也使得其成为获取优质蛋白的绝佳原料。海参在经过蛋白酶水解后得到的海参肽中小分子肽的含量占大多数，在经过膜过滤浓缩后，可用于抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等多种活性功能上，并且都有显著功效，对海参产品未来的功能性发展具有重要意义[9]。
1.2.2 海参多糖
海参内脏里的多糖主要存在于海参的生殖性腺及肠壁体里，海参多糖在结构上本质属于杂多糖，Vieira 等[10]发现海参多糖主要由海参糖胺聚糖组成，硫酸基通过葡萄糖醛酸与糖胺聚糖相连接；Borsing 等从海参中提取得到一种硫酸软骨素岩藻糖（Fuc CS），Kariya 等从刺参体壁中分离纯化得到两种带硫酸基的酸性粘多糖[11]。若想获取多糖，必须破坏多糖的链接及和其他物质的共价结合，从而才能获取到多糖。多糖结构有一级到四级等多种结构，但是为了方便研究通常以多糖的一级结构为主，为了其中多糖的提取与分离纯化。海参多糖的提取方法主要有碱提法和蛋白酶水解法，但是这两种方法提取出的多糖纯度很低，所以需要进一步纯化，一般常用分级沉淀法、色谱分离法、电泳法等[12]。海参多糖也具有多种生物活性如抗凝血活性，樊绘曾等通过酶解、醇沉、氧化脱色等基于刺参体壁分离刺参酸性粘多糖，通过给家兔注射刺参酸性粘多糖后血循环中有着相对更少的血小板数量，除此之外还有抗肿瘤、抗氧化活性等[13]。
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第二章 发酵海参内脏酶解液的工艺研究
2.1 引言
海参内脏在经过蛋白酶的分解作用后，其内部的海参多肽变成小分子蛋白肽和部分游离氨基酸，而海参内部特有的营养物质如海参多糖与海参皂苷等也保留在酶解液中[6]。随着乳酸菌的加入，在进一步的发酵过程中，海参内脏原有的营养物质得以保留[42]，而乳酸菌通过自身的生长代谢，通过整合发酵液中各个营养物质从而发生复杂的化学反应，进而产生某些新的功能活性物质和代谢产物[58]，但是该产物的具体类别有待于进一步的研究。此外，乳酸菌本身也具有一定的营养作用，发酵使用的嗜酸乳杆菌是人和动物肠道内的主要微生物之一，当存在一定数量时，能够改变人体内肠道中的微生物环境，从而促进肠道蠕动或者杀死有害微生物，从而促进食用该类微生物的个体健康。经研究报道，嗜酸乳杆菌具有抗肿瘤、抗氧化、提高人体免疫力等多种生物活性，近些年来也因为种种有益效果开始被人们熟知而逐渐成为研究的热点。而嗜热链球菌的使用历史更为悠久，早在 1907 年就因为能促进胃肠道健康而被人们所知，经常以单菌或者与德氏乳杆菌保加利亚亚种作为发酵剂菌株来生产酸奶[59]。嗜热链球菌在乳品发酵中的主要作用就是迅速产酸，其还能产生胞外多糖（EPS），能防止酸奶脱水收缩。嗜热链球菌还可以提高乳糖不耐症人群的乳糖耐受效果，促进肠道免疫系统发挥作用，减轻特定癌症的发生风险[60]。酵母菌是一种兼性厌氧型微生物，酵母菌有氧发酵是利用糖产生二氧化碳和水，进而降低溶液的 pH，无氧条件下则利用糖产生酒精和二氧化碳，进而使溶液内产生乙醇[61]。酵母菌发酵还可以产生一定的 SOD[62]，SOD 是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是重要的氧自由基清除剂，能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成 H2O2 和 O2，SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。
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2.2 实验材料与仪器
2.2.1 实验材料
表 2-1 实验材料及生产商
表 2-2 主要实验试剂及生产商
第三章 乳酸菌发酵海参内脏酶解液对结肠癌小鼠的抗肿瘤作用 .......................32
3.1 引言..................................32
3.2 材料和仪器 ........................32
第四章 不同发酵方式对海参内脏酶解液风味的影响 .......................40
4.1 引言..............................................40
4.2 实验材料与仪器 .....................................40
第五章 结论与展望 ...................................48
5.1 结论 .........................................48
5.2 展望....................................49
第四章 不同发酵方式对海参内脏酶解液风味的影响
4.1 引言
海参内脏无法作为名贵商品像海参那样流入餐馆等消费场所，最大的原因就是它的形态和气味无法让人接受，以致于其至今没有规模性的市场。但是海参内脏在经过酶解和发酵后，难以让人接受的固体外观变成了赏心悦目、澄清均匀的液体，从而使得海参内脏的食用价值和消费地位大大提高。并且由于海参内脏内部蛋白质分子的改变，使得其风味也发生了改变，其中除了腥味有着明显的减少之外[89]，使用不同的菌种如乳酸菌类、酵母菌类发酵后还会赋予产品不同的风味和滋味，但是由于目前有关海参内脏及其产物的标准和法规的不完善，对如何评价海参内脏的品质也一直无法统一，不同地区、不同季节、不同纬度下生长的海参风味有所不同[90]，它们的海参内脏的风味也会有所不同，如果单纯凭借人工感官评价，一是无法精准的描述出发酵后海参内脏的风味和滋味，二是人工费时费力，会提高生产成本，其感官评定结果还会因为受到个人情绪、所处环境等种种限制而不够具有说服力，而电子舌、电子鼻作为近些年迅速崛起的仿生人类感官系统，由于具有检测成本低廉、操作方法简便、呈现结果精准等等的优点，将它们联合用于研究食品风味方面的研究已经日益成熟并规模化[91, 92]，并且正在日益规模化。虽然电子舌和电子鼻由于功能相似且多用于液体样品[93]，非常契合发酵海参内脏酶解液的产品性质，但是就总体而言，将电子舌、电子鼻联合应用于海参及其深加工产物的相关文献还是比较少。
本章以不同菌种发酵后的海参内脏酶解液为主要研究对象，采用电子舌、电子鼻对不同发酵方式（酵母菌发酵和复合乳酸菌发酵）后的风味和滋味进行分析评价，研究不同发酵方式对海参内脏酶解液品质造成的影响，为海参的深加工、海参内脏的品质化管理和综合利用提供理论规划。
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第五章 结论与展望
5.1 结论
由于海参内脏的营养成分高，还具有一定的功能活性，为解决海参内脏被无端浪费、固体形态难以被人们接受、气味令消费者抗拒、海参内脏相关产品市场流通较少等等的难题，本文以海参内脏为原料，在利用蛋白酶将其酶解后，利用酵母菌发酵或者复合乳酸菌发酵两种不同的发酵方式，采用单因素试验和正交结合的方法对发酵型海参内脏酶解液的工艺进行优化，并以 SOD 活性检测酵母发酵产物、DPPH 自由基清除能力检测乳酸菌发酵产物的抗氧化性能，建立肿瘤小鼠模型，通过抑瘤率和瘤重变化研究乳酸菌发酵产物是否具有体内抗肿瘤活性。在人感官评价的基础上，同时利用电子舌、电子鼻联合的方式代替人类感官系统研究不同发酵方式下对海参内脏酶解液风味和滋味的影响，为海参及其产物的深加工提供实验数据和理论基础，为海产品尤其是海参行业的繁荣昌盛贡献出自己的一份科研力量。本文章研究内容具体结果如下：
（1）酵母菌制备发酵海参内脏酶解液的工艺优化
酵母菌在发酵过程中通过生长代谢活动可以产生酸和酒精，而酵母菌的新陈代谢不仅可以降低海参内脏酶解液原有的腥味气体，还会使发酵体系中发生复杂的化学变化，从而产生一些特有的活性物质比如 SOD。SOD 是酵母菌在生长过程中会产生释放的一种金属酶，具有较强的氧自由基清除能力，一般的作为一种功能酶来进行抗氧化活性的评价，所以选择酒精度和 SOD 活性作为评价酵母菌发酵的指标，试验得出的最佳工艺条件为：发酵液初始糖添加量为 16%，酵母菌接种量为 0.06%，发酵温度 38 ℃，发酵时间为 10 h。此条件下得到的最优产品的人工感官评价为 92 分，发酵液酒精度 8.8 %vol，SOD 酶活力为 46.26 U/mL，ABTS 自由基清除率为 42.82%。
（2）乳酸菌制备发酵海参内脏酶解液的工艺优化
将乳酸菌应用于海产品中近些年来已经成为了热门的趋势。合适的益生菌不仅会给其生长的体系带来更多的营养物质，还会赋予产品崭新的生理功能活性，同时由于部分乳酸菌快速产酸的特点，在抑制有害菌群生长的同时完美的弥补了海洋产品容易腐败的缺陷，并且很多乳酸菌的生长代谢活动还能为产品提供更多怡人的风味物质，改善产品的质地。同样将海参内脏酶解液作为发酵基质，以发酵终点的 pH 和发酵液中 DPPH 自由基的清除率作为评价指标，对乳酸菌发酵海参内脏酶解液的工艺进行优化，研究结果显示复合乳酸菌添加量为 0.5%，ST:LB复配比例为 1:1，乳糖添加量为 4%，发酵时间为 7 h 时为乳酸菌发酵的最佳工艺条件，此时发酵液的 pH 为 3.71，DPPH 自由基清除率为 71.63%，ABTS 自由基清除率为 54.75%，酸度为 41 °T，最优条件下产品的感官评分为 94 分，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌群经过检测均符合国家食品安全标准。
参考文献（略）