第一章 前 言
1.1.拟除虫菊酯类杀虫剂
拟除虫菊酯是一类高疏水性仿生杀虫剂。常见的拟除虫菊酯类杀虫剂有溴氰菊酯和氯氰菊酯。拟除虫菊酯具有广谱高效、杀虫活性强、用量少和生物可降解性等优点，在农业生产得到广泛应用，主要应用于蔬菜水果、棉花、谷物以及家庭中的各种病虫防治。
1.1.1.拟除虫菊酯类杀虫剂残留问题
随着有机氯、有机磷和甲胺磷等高毒杀虫剂的退市，未来 5-10 年，拟除虫菊酯杀虫剂的需求还会快速增长（韩永奇, 2010）。随着拟除虫菊酯类杀虫剂的广泛和长期使用，菊酯类杀虫剂残留问题带来的危害也日益紧迫。拟除虫菊酯类农药带来的危害主要有以下三方面：
1.1.1.1.危害人类健康
拟除虫菊酯类农药在自然条件下难以降解，撒落在田间的菊酯类农药部分残留在土壤中，部分随地表水流入江河湖泊或进入地下水，污染水源。蔬菜水果等食品上会残留低剂量的菊酯类农药，经食用后会积累在人体的淋巴结、脾脏等器官，容易引起体内激素分泌异常，诱发多发性神经病、中风等症状，甚至产生致癌作用（Fakata et al., 1998; Miyamoto et al., 1995）。
1.1.1.2.对非靶标生物毒害作用
大部分长时间残留的拟除虫菊酯类农药对蜜蜂、家蚕和蝶类等农业有益生物危害极大，对哺乳动物生理活动影响也很大，甚至会产生致癌致突变作用（Malley,1997; Shukla et al., 2002）。研究还发现，家蚕即使处于含微量氯氰菊酯的环境中，其死亡率大大提高（鲁兴萌 等, 2003）。另外，大多数菊酯类农药对水生动物有很强毒性。例如，研究发现甲氰菊酯对罗氏沼虾幼体具有很强的毒性，在 26 ℃水温条件下，甲氰菊酯在 24 h 内对各期罗氏沼虾幼体的 EC50（引起 50%个体有效的剂量）最高也不超过 0.08 μg/L，而且越是发育到后期的幼体，对甲氰菊酯越敏感。（林小涛 等, 1997）。
1.1.1.3.影响农产品出口
根据西方发达国家卫生与植物卫生协议（sanitary and phyto-sanitary agreement,SPS） 的要求以及菊酯类农药的最大残留限度（Maximum Residue Limits, MRLs）标准，我国的很大一部分出口农产品中，菊酯类农药残留量往往比西方国家偏高许多，因此给我国农产品的出口贸易造成了很大的困难，尤其是在加入 WTO 后，许多国家为了保护竞争力弱小产业，人为对进口我国的农产品农药残留量设置越来越严格和苛刻的限量标准，该标准在实际操作中，已成为食品和农产品国际贸易中的绿色壁垒（程国锋 等, 1998）。特别是茶叶出口问题，由于我国制定的茶叶最高残留限量（MRL） 标准参考值为 2 mg/kg，比国外实施的 0.1 mg/kg 的标准高出 20 倍，因此给我国茶叶的出口贸易造成很大的阻力。我国是茶叶生产大国，由于农药残留问题而致使我国大量茶叶不能出口，造成经济损失非常巨大。另外，许多具备竞争潜力的农产品包括水果、蔬菜、蜂蜜乃至大米等产品，近年来屡次遭受国际贸易绿色壁垒的阻碍而不能出口，造成了巨大的经济损失（陈宗懋, 2001）。而在国内农产品贸易中，菊酯类农药的残留问题也是一个潜在危害人民健康的因素。
第二章 摇瓶培养基以及培养条件的优化
本实验室已成功构建出 拟除虫菊酯类农药降解酶表达菌株 E.coliBL21/pET28a-sys410，该菌株表达菊酯类农药降解酶高效且稳定，表达的产物具有良好的热稳定性和 pH 稳定性，其在常温条件下即可对拟除虫菊酯进行降解。为了提高酶的产量，本章主要对该拟除虫菊酯类农药降解酶生产菌株的摇瓶培养基和培养条件进行优化。
碳源是微生物生长的一类重要营养物质，其化学本质是含碳化合物。 常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、机酸酯和小分子醇。不同的微生物根据其产生的酶系不同，可利用的碳源也不同。在众多碳源中，葡萄糖具有容易被微生物代谢、价格低廉和使用方便等优点，因此，常被用作工业发酵的首选碳源和培养基的主要成分，但以葡萄糖作为碳源时，高浓度的葡萄糖容易导致大量乙酸产生。研究表明，以甘油作为碳源可明显减少乙酸的积累（尹淑琴 等，2007）。从表2-1 可以看出，本论文菌株利用葡萄糖不理想，在含 10 g/L 葡萄糖的 2×YT 培养基中摇瓶培养，获得的密度 OD600=4.39，比在不含葡萄糖的 2×YT 培养基中获得的菌体密度低（OD600=5.8）。另外，也发现本论文菌株对二糖和多糖利用也不理想，在含 10 g/L 的淀粉和玉米粉的 2×YT 培养基中，菌体密度 OD600分别为 4.04和 4.09，产物酶活力分为 24.5 U/ml 和 22.5 U/ml。结果表明，本论文生产菌株利用甘油作为碳源时，获得的菌体密度最大 OD600=6.09，农药降解酶活力最高为48.5 U/ml，所以选定甘油作为发酵培养基碳源。
第三章 重组大肠杆菌在 7.5 L 发酵罐上研究 ...................................48-63
引言 ..................................48
3.1. 材料.................................. 48-49
3.2. 方法.................................. 49-52
3.3. 结果与分析.................................. 52-58
3.4. 讨论.................................. 58-61
3.5. 小结 ..................................61-63
第四章 重组大肠杆菌高密度培养的研究.................................. 63-70
引言 ..................................63
4.1. 材料.................................. 63-64
4.2. 方法.................................. 64-66
4.3. 结果与分析.................................. 66-67
4.4. 讨论.................................. 67-69
4.5. 小结.................................. 69-70
第五章 拟除虫菊酯类农药降解酶粗酶粉的制备.................................. 70-74
引言.................................. 70
5.1. 材料.................................. 70
5.2. 方法 ..................................70-71
5.3. 结果与分析 ..................................71-72
5.4. 讨论 ..................................72-73
5.5. 小结 ..................................73-74
结论
1) 对重组大肠杆菌（E. coli BL21/pET28a-sys410）进行摇瓶培养研究，得到优化培养基配方为：甘油 20 g/L、酵母粉 20 g/L、硫酸铵 8 g/L、磷酸盐 100 mmol/L、硫酸镁 5 mmol/L、微量元素混合液 1.5 ml/L。考察了发酵条件和诱导条件对重组大肠杆菌生长和酶表达的影响，确定了优化的发酵条件和诱导条件为：250 ml三角瓶装液量 50 ml、初始培养基 pH=7.0、接种量 2%，接种培养 8 h 后，加入终浓度 6 g/L 乳糖，在 37 ℃条件下继续诱导培养 8 h。使用优化的培养基和培养条件培养重组大肠杆菌，最终获得的菌体密度 OD600达到 10.4，是优化前的 1.8倍，酶活力也达到 97.4 U/ml，是优化前的 2 倍。
2) 优化出一套适合重组大肠杆菌在 7.5 L 发酵罐上生长和酶表达的发酵工艺：以较低碳氮源浓度的初始培养基进行发酵，使用双管道通气，在发酵前期采取恒速补料，发酵后期采取恒溶氧补料培养，获得的最高菌体密度 OD600达到 145，合适的诱导起始点是菌体对数生长中后期，最终获得的酶活力达到 3000 U/ml。
3) 研究了重组大肠杆菌在 30 L 和 100 L 发酵罐上高密度培养，最终获得的菌体密度 OD600为 88 和 83，酶活力 1750 U/ml 和 1560 U/ml。