1前言
1.1研究背景
40%的陆地由草原覆盖，但超过50%以上的草地却被变成牧场，已经处于退化状态。为了恢复土壤生产力，提高因过度放牧导致的退化草地的植被覆盖率，氮素被普遍添加。但氮素的累积却带来生物多样性的减少，生态系统恢复功能的减弱等环境负面效应，而其生态效应有待于科学全面评估。
1.1.1氮循环与草原农业生态系统
氮是大气圈中含量最丰富的元素，同时也是大多数农田以及自然陆地生态系统中植物光合作用和初级生产过程中最受限制的营养元素之一。草地是仅次于森林的极其重要的陆地生态系统。在草地生态系统中，氮的生物地球化学循环主要是在大气、土壤、动植物以及微生物之间进行。
大气中分子态氮可以说是取之不尽，但是只有少数原核微生物能吸收同化氮气(N:)。土壤中的有机态氮只有通过转化才能被植物利用，不断地补充土壤中按盐和硝酸盐即氮素才能使植物生长良好。农业生产中无机氮的来源一方面是氮素的添加，另一方面是通过氮素的循环作用。氮素循环(图1一1)主要包括:①固氮作用:大气中分子态氮被固定成氨;②同化作用:氨被植物吸收利用，合成有机氮进入食物链;③氨化作用:有机氮分解释放氨;④硝化作用:氨被氧化为硝酸;⑤反硝化作用:硝酸被还原为分子态氮返回大气。进入沉积物中的氮一般脱离生物循环的轨道。
硝酸盐在微氧或无氧条件下，能被多种微生物异化还原成亚硝酸盐，并进一步还原成分子态氮，这种反硝化作用常造成土壤根层氮肥的损失，同时其部分中间产物(NO和NZO)造成环境污染，产生不良后果。人们发展农业生产的同时，还必须提高对氮素循环中各个环节的了解，以便在氮素施用和管理上采取合理措施，有效利用氮素，利于环境保护。
1.1.2硝化作用及其农业和环境意义
硝化作用是氨的氧化过程，分为两个阶段完成，即氨氧化(a~oniaoxidation)和亚硝酸氧化(nitriteoxidation)过程。氨氧化作用，也称亚硝化作用，是硝化作用的第一个反应步骤，也是限速步骤，是全球氮循环的中心环节。氨氧化为硝酸以及大量的硝态氮化肥为作物生长提供氮素营养，有利于产量的提高。但是硝酸盐的溶解性强，容易随雨水而流失。硝态氮肥料的利用率在40%以下，大部分浪费了。硝酸盐向水体迁移，导致湖泊和近海富营养化和赤潮为害。水中的硝酸盐会被兼性厌氧微生物还原为NOZ一，被人食用后N02与血液中的氧结合，影响在血液中的转移，造成“高铁血红蛋白症”，影响人的健康，并可导致婴儿死亡。因此，世界卫生组织规定，饮水中硝酸盐的含量应低于lomg/L。土壤中的NO3过高而植物的生长又受到不良环境(如干旱、阴蔽和多云天气)限制时，植物中会积累过多的硝酸盐，硝酸盐含量过高的植物在青贮过程中会被反硝化细菌还原为NoZ，并形成有毒气体在青贮窖中积累，人蓄吸入后严重者可以致死。
2长期不同氮素梯度下氨氧化微生物数量、多样性分析
氮素是很多生态系统(包括草原)中限制植物生长和生产力高低的重要因素，氮素的添加不可避免，而大气氮沉降的加剧也使土壤中的氮素积累日益严重。由微生物催化的硝化作用是全球氮循环的一个重要环节，与土壤养分的供应和硝酸盐污染问题有着紧密的联系。但对于内蒙古地区土壤中氮素的积累对土壤硝化过程和相关微生物的影响还缺乏深入的研究。
氨氧化微生物是硝化过程的主要驱动者，能将氨态氮氧化为亚硝酸，而亚硝酸很不稳定，易被氧化成硝酸(，所以氨氧化微生物在硝化过程中起着关键作用。氨氧化微生物主要有氨氧化细菌(Anllnonia一oxidizingbacteria，)和氨氧化古菌(Anllnonia一oxidizingarchaea，AOA)两大类。近些年来AOA的发现使得长期以来关于氨氧化过程主要由细菌驱动的观点发生了动摇，虽然一些研究显示细菌是很多土壤中氨氧化过程的主要驱动者，但对于土壤中大量存在的AOA的功能仍缺乏足够的认识。同时研究AOB和AOA对全面了解氨氧化过程是必不可少的，而为了分析复杂自然环境下AOB和AOA的生理代谢规律及其生态功能，有必要对影响其组成和活性的环境因子进行更多的研究。
本研究利用中科院内蒙古草原生态系统定位站的长期氮素添加实验平台，分析了添加不同浓度氮素下土壤氨氧化菌的组成及其与土壤氨氧化潜势和理化性质间的联系，以探讨以下问题:不同程度的氮素积累如何影响内蒙草原土壤氨氧化菌的组成和氨氧化活性AOB和AOA的数量和群落结构的变化与氨氧化速率和土壤理化性质的变化间有着怎样的联系?影响土壤氨氧化速率和氨氧化菌组成的主要因素是什么？
3 土壤中氨氧化微生物对pH的响应 …………………………..31-37
3.1 材料和方法…………………………..31
3.1.1 样地介绍………………………….. 31
3.1.2 土壤理化性质测定………………………….. 31
3.1.3 土壤氨氧化潜势的测定………………………….. 31
3.1.4 总基因组DNA的提取………………………….. 31
3.1.5 实时定量PCR分析………………………….. 31
3.1.6 T-RFLP分析………………………….. 31
3.1.7 数据分析………………………….. 31
3.2 结果…………………………..31-34
3.2.1 土壤理化性质与氨氧化潜势………………………….. 31-32
3.2.2 AOA和AOB的丰度…………………………..32-34
3.3 讨论…………………………..34-37
4 氨氧化微生物的富集培养…………………………..37-43
4.1. 材料与方法…………………………..37-38
4.1.1 实验设计………………………….. 37-38
4.1.2 理化性质等指标的测定…………………………..38
4.1.3 基因组DNA的提取………………………….. 38
4.1.4 实时定量PCR分析………………………….. 38
4.1.5 克隆文库的构建及序列分析………………………….. 38
4.1.6 数据分析………………………….. 38
4.2 结果与讨论…………………………..38-43
4.2.1 AOA富集结果…………………………..38-41
4.2.2 AOB富集结果………………………….. 41-43
5 结论与展望………………………….. 43-45
5.1 结论…………………………..43
5.2 展望………………………….. 43-45
结论
氮素积累在导致土壤中氨浓度升高的同时往往伴随着土壤因硝化作用增加而导致土壤酸化，氨浓度和pH值的变化都是影响氨氧化微生物组成和活性的重要因素，也很可能成为氮素积累影响氨氧化过程的主要机制。
本论文利用野外长期添加不同浓度氮素和不同pH处理实验平台，结合室内培养实验，研究了氮素添加和土壤pH调节对内蒙古典型草原土壤氨氧化细菌和古菌的数量、群落结构和氨氧化活性的影响，得到以下主要结论:
(l)长期添加不同浓度氮素处理中，随氮浓度增加，土壤pH值和氨氧化速率下降显著，氨氧化细菌的数量上升，而氨氧化古菌的数量只有在高浓度氮素下有明显下降。氨氧化细菌的数量与土壤氨浓度呈极显著正相关，与土壤氨氧化速率、pH呈极显著负相关;而氨氧化古菌数量与土壤氨浓度呈极显著负相关，与土壤氨氧化速率、pH呈极显著正相关。对不同pH处理的研究结果显示，随土壤pH值降低，土壤氨氧化速率和氨氧化细菌的数量降低且二者呈正相关性;而氨氧化古菌的数量增加明显但与氨氧化速率间无显著相关性，说明酸性环境有利于AOA的生长，但AOA对氨氧化的贡献不明显，其功能有待进一步研究。土壤pH值是决定PNR的主要因素，而土壤中氨浓度的变化则对AOB和AOA的数量起着重要的影响。
(2)氮素添加导致氨氧化细菌的群落结构发生了显著变化，主要组成类群从不添加氮素时的Cluster3al逐渐转变为中等浓度添加时的Cluster3aZ和高浓度添加时的ClusterZ。室内模拟培养研究结果表明，中性条件加氨培养可以促进Cluster3aZ含量增加，而酸性条件下培养则会导致ClusterZ含量的增加，这些结果证实了氨浓度和pH值在氮素添加引起的氨氧化细菌群落结构变化中的作用。在氮素添加和pH平台中，氨氧化古菌的群落结构变化都不大，对氨浓度和pH值的响应不如氨氧化细菌敏感。