本文是一篇药学论文，网络药理学筛选结果显示，汉黄芩素会与FN1并发挥抗癌作用，但本研究结果证明汉黄芩素并不会影响MMP2和MMP9蛋白含量的变化。
材料与方法
1 材料与试剂
1.1 主要试剂
药学论文参考
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2 实验方法
2.1 细胞培养
2.1.1 细胞复苏
从-80 ℃冰箱中取出HepG2和Hep3B肝癌细胞株，立即放入37 ℃水浴中使细胞快速融化；将细胞悬液吸至15 mL离心管中，800rpm离心5 min；弃掉上清液，加5 mL完全培养基重悬细胞后转移至25cm2培养瓶中；十字混匀后标记细胞信息并放置于37 ℃二氧化碳浓度5%培养箱中培养。
2.1.2 细胞换液
用移液枪从培养瓶中吸去培养基；用含1%双抗的PBS冲洗细胞一次；重新加入5 mL完全培养基后放回37 ℃二氧化碳培养箱。
2.1.3 细胞传代
细胞铺满80%以上之后，吸去培养瓶中的培养基然后用含1%双抗的PBS冲洗三次；加入1 mL不含EDTA的0.25%胰酶，在37 ℃培养箱中消化2 min。待细胞之间存在间隙时加入2 mL完全培养基终止消化，并将细胞吹打至悬浮状态；将细胞悬液转移至15 mL离心管中以800rmp离心5 min后弃去上清；用2 mL完全培养基将细胞重悬，然后分装至2个培养瓶中并补充完全培养基至5 mL。
2.1.4 细胞冻存
细胞铺满80%以上之后，吸去培养瓶中的培养基然后用含1%双抗的PBS冲洗三次；加入1 mL不含EDTA的0.25%胰酶，在37 ℃培养箱中消化2 min。待细胞之间存在间隙时加入2 mL完全培养基终止消化，并将细胞吹打至悬浮状态；将细胞悬液转移至15 mL离心管中以800 rmp离心5 min后弃去上清；按DMEM基培∶胎牛血清∶DMSO = 7∶2∶1的比例配成冻存液。用2 mL冻存液将细胞重悬后分装至2支冻存管中。封口膜封口后标注细胞信息。放入程序冻存盒后放到-80 ℃冰箱中冻存。
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结果
1 细胞培养结果
实验用细胞为HepG2肝癌细胞和Hep3B肝癌细胞。细胞生长良好，传代3次后进行下一步试验（详见图 9）。
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2 流式细胞检测细胞凋亡
流式细胞检测的结果显示，随着给药时间的增长，圣草酚组，槲皮素组和木犀草素组的早凋细胞占比在3天时间内呈增长态势。但汉黄芩素组的细胞凋亡率并未发生显著变化（详见图 10）。这一现象说明汉黄芩素可能并没有促使肝癌细胞凋亡的作用。因此其发挥作用的具体机制还有待进一步研究。
药学论文参考
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第二部分……………………28
材料与方法…………………28
结果……………………37
小结……………………41
讨论…………………………42
结论……………………44
讨论
本研究不同于传统网络药理学分析方法，在筛选疾病-靶点信息时使用CPTAC数据库中的蛋白质组数据而非转录组数据。这是因为蛋白在体内表达状况复杂。虽然大多数情况下mRNA与蛋白质的表达情况是正相关的。但是非编码RNA，其他蛋白等多种情况都有可能导致两者表达趋势不一致。故本研究选择分析蛋白质组表达信息，用转录组数据矫正的方法筛选有效靶点。然后通过蛋白互作网络的方式筛选出潜在重要的靶点，并用生存分析的方法筛选出与预后相关的核心靶点，最后用计算机进行模拟分子对接以验证该方法理论上的可行性。这种筛选方式既确保了靶点的真实有效，也可以根据需要筛选出特定作用的靶点。例如用生存分析可以筛选出生存相关的核心靶点。临床相关分析则可以筛选出与病理分级相关的靶点。最终确定靶点后通过GSEA富集分析可以直观地看到筛选出的靶点所参与通路进而推断出其在细胞中发挥的作用以及药物有效成分与其结合后，可能是如何发挥作用的。在本研究中就是通过这种方法最终筛选出FN1和HMOX1两种预后相关的关键靶点。然后进入下一阶段进行实验验证。
FN1是纤维连接蛋白，在细胞基质和细胞-细胞黏附、细胞迁移、形态发生、分化和癌变中起重要作用[43]。其作用在喉癌，大肠癌，口腔鳞状细胞癌，胶质细胞瘤，乳腺癌，卵巢癌等多种癌症中已被证实。在一个胃癌的相关研究中提到，在敲除FN1的癌细胞中MMP2和MMP9的表达量会下降，FN1理论上也是通过这一途径来控制胃癌细胞的迁移和侵袭的[36]。但是后续实验研究结果显示， MMP2和MMP9的含量在实验中并未见明显变化[44]。本研究中WB的实验结果也验证了这一说法。但是qPCR的结果显示MMP2和MMP9的mRNA含量在HepG2细胞中显著提高。这一结果提示我们FN1可能会影响MMP2和MMP9的转录。但又存在其他因素会影响将mR NA翻译成蛋白质的过程。本研究通过分子对接推测汉黄芩素可以和FN1结合。汉黄芩素已证实具有抗癌作用。已知汉黄芩素的抗癌机制可以通过抑制Cyclin D1以抑制细胞周期[27]
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结论
1. 根据药理网络的信息可以得知，主要来自于复方中皂角刺、半枝莲、沙苑子、白花蛇舌草和黄芪的槲皮素，主要来自于丹参、党参和半枝莲的木犀草素以及主要来自于半枝莲的圣草酚会导致肝癌细胞凋亡。并且这些成分能够显著提升肝癌的预后效果。
2.槲皮素、木犀草素和圣草酚能够作用于HMOX1进而抑制GPX4的表达，这会使肝癌细胞进入一种可持续性凋亡的状态。
3. 网络药理学筛选结果显示，汉黄芩素会与FN1并发挥抗癌作用，但本研究结果证明汉黄芩素并不会影响MMP2和MMP9蛋白含量的变化。
参考文献（略）