第一部分 基于功能化富勒烯和金属有机框架的纳米杂化物用于人血清 miR-3675-3p 的检测分析研究
1.1 实验部分
1.1.1 材料与试剂
富勒烯 先丰纳米材料公司乙炔黑 艾维信化工科技有限公司氨基封端的聚酰胺-胺大分子 Sigma 公司 （美国）氯金酸 Sigma 公司 （美国）氯铂酸 Sigma 公司 （美国）2-氨基对苯二甲酸 Sigma 公司 （美国）四正辛基溴化铵 云叶生物技术有限公司牛血清白蛋白 百灵威科技有限公司六水氯化铁（99%） Aladdin 公司（美国）壳聚糖 成都科龙化工试剂厂抗坏血酸 成都科龙化工试剂厂硼氢化钠 成都科龙化工试剂厂甲 苯 川东化工有限公司
1.1.2 实验所用核苷酸序列
Nucleotide name Nucleotide sequence (5′→3′)miR-3675-3p (Target) CAUCUCUAAGGAACUCCCCCAACapture Probe (CP) CCTTAGAGATG-(CH2)6-SHSignal Probe (SP) SH-(CH2)6-TTGGGGGAGTTLet-7d-5p AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUUSingle base mismatch (SBM)a CAUCUCUAAGGAACUCACCCAAForward primer ACACTCCAGCTGGGCATCTCTAAGGAACTDownstream primer TGGTGTCGTGGAGTCGReverse primerCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTTGGGGAGa：划线加粗的碱基为错配碱基
药学论文参考
1.2 结果与讨论
1.2.1 纳米材料的选择
C60 是一种具有内在氧化还原活性和强烈电子接收能力的碳材料，被广泛应用于生物传感器中。MOF 具有多孔隙和易功能化的特点，但导电性较差。因此，C60被掺杂至 PAMAM-MOF 中，以 PAMAM 作为模板，借助 C60 和 NH2 的超分子作用力 通 过 相 转 移 法 成 功 制 备 C60@PAMAM-MOF 。 幸 运 的 是 ， 我 们 发 现C60@PAMAM-MOF 纳米杂化物的协同作用，不仅可以提高 C60 和 MOF 的导电性，还可促进 C60 的氧化还原活性实现信号放大。此外，CS-AB 和 Au@PtNPs 的传感平台进一步增强导电性和增加捕获探针的固载密度，使传感器呈现更高的灵敏度。因此，我们选择 CS-AB 和 Au@PtNPs 作为传感界面、C60@PAMAM-MOF 作为信号放大器。
1.2.2 纳米材料的形貌和元素表征
纳米材料的形貌通过 SEM 表征。纯 MOF（图 2A）为规则的八面体结构，与已报道的文献一致[18]；PAMAM 功能化 MOF 之后因其物理吸附在表面，导致规则的八面体聚集在一起（图 2B）；掺杂 C60 之后，可观察到不同尺寸的不规则圆球通过 C60-NH2 结合在 PAMAM-MOF 上，展现更多的比表面积（图 2C）；图 2D 所示，可观察到明显的亮点，说明 AuNPs 被成功还原至 C60@PAMAM-MOF 中。
此外，EDS 和 TEM 表征进一步证明了复合材料中元素的含量和分布。如图2F 所示，可观察到碳（红）、铁（黄）、氧（蓝）和氮（绿）元素均匀分布在C60@PAMAM-MOF，说明 C60@PAMAM-MOF 合成成功。最后，如图 2E，可观察到 Au 元素，证明了 C60@PAMAM-MOF-AuNPs 的成功合成。
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第二部分 基于聚苯胺掺杂的 MXene-AB 纳米复合物耦合 3D NML@N-CNTs 纳米花的同源适体传感器检测结核 ESAT-6 抗原的分析研究.................... 32
前 言................... 32
2.1 实验部分........................... 33
2.2 结果与讨论................................ 36
2.3 结论.................................. 43
第二部分 基于聚苯胺掺杂的 MXene-AB 纳米复合物耦合 3D NML@N-CNTs 纳米花的同源适体传感器检测结核 ESAT-6 抗原的分析研究
前言
结核病（Tuberculosis, TB）是一种由结核分枝杆菌感染、通过气溶胶传播的致病性传染病，于 1882 年罗伯特发现。据 WHO 报道，截止 2018 年已有 170 万人遭受着 TB 的折磨[1]，虽其发病率在缓慢下降，但耐药率呈不断上升的趋势，全球的负担仍很重[2]。至今，TB 的诊断方法包括抗酸杆菌镜检、痰涂片镜检、药物敏感性测试、PPD 试验、γ-干扰素释放实验、核酸分子杂交和 GeneXpert 测试等，但上述的方法存在些许不足（如耗时、敏感性低和成本效益高等），所以亟待寻找一种生物标志物快速的诊断 TB。研究报道[3]，结核分枝杆菌分泌的靶抗原对其有保护作用。ESAT-6（6kD early secreted antigenic target）是一种早期分泌靶抗原，由 RD1 区域（又称为 ESX-1 分泌系统，只存在于致病性分枝杆菌中，在 BCG 和非典型结核分枝杆菌缺失）中的 Rv3875 编码。实验证实[4]，ESAT-6是最具免疫原性的结核特异性抗原，因其特殊的编码位置和较高的特异性（高于PPD 实验）在 TB 生物标志物中脱颖而出，也被认为是最有潜力的 TB 疫苗候选物，故检测 ESAT-6 对 TB 诊断具有重要的临床价值。
电化学适体传感器是基于适体和靶标高亲和力结合检测靶标的过程，被广泛应用于生物标志物的检测中，但目前使用电化学适体传感器检测 ESAT-6 的文献鲜有报道。为了提高传感器的检测灵敏度，引入纳米材料产生和放大信号，其中过渡金属碳材料和聚合物一直受到研究人员的青睐。碳化钛（MXene）是一种由金属碳化物和氮化物组成的过渡金属材料，形态与石墨烯类似（单层厚度约 1nm、横向尺寸约几百纳米到几十微米不等），已被广泛应用于储能、电池、电容器、传感器和抗菌等领域。但多层的 MXene 较易沉聚，故应对其表面改性增加稳定性。乙炔黑（AB）是乙炔经高温煅烧制备而成，具有导电性强、质量轻和易获取等特点。聚苯胺（PANI）是一种常见的、易合成和化学稳定性好的导电聚合物，富含有大量的氨基和亚氨基可为复合材料的制备提供结合位点，同时还具有氧化还原活性和还原性被当作是理想的电活性材料。在本研究中，我们发现将 PANI 掺杂至 MXene-AB 形成的 MXene-AB-PANI 纳米复合物，显示出优异的氧化还原活性，发现导电性 AB 不仅作为 MXene 的稳定剂和掺杂剂，还可协同MXene 增强 PANI 的氧化还原活性。此外，由氮-掺杂碳纳米管（N-CNTs）复合镍锰双氢化物（NiMn LDH, NML）制备的 3D 花状 NML@N-CNTs 显示了杰出的稳定性和导电性，作为传感基质放大信号。
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2.1 实验部分
2.1.1 材料和试剂
六水硝酸镍（98%） Aladdin 公司四水乙酸锰（99%） Alfa Aesar 公司乌洛托品（99.5%） Aladdin 公司氮掺杂碳纳米管 先丰纳米材料有限公司碳化钛 MXene（多层） 先丰纳米材料有限公司乙炔黑 艾维信化工科技有限公司苯胺 百灵威科技有限公司链霉亲合素 Aladdin 公司牛血清白蛋白 百灵威科技有限公司ESAT-6 抗原 Prospec-Tany 科技有限公司（以色列）γ-干扰素 R&D Systems 公司（美国）过硫酸钾（99%） 百灵威科技有限公司
将 Ni(NO3)2·6H2O（30 mM）和 Mn(CH3COO)2·4H2O（10 mM）溶于 20 mL 超纯水中搅拌 5 min，加入 HMTA（0.6 M）继续搅拌 30 min，将混合溶液转移至高压反应釜中 80 °C 反应 12 h，自然冷却至室温，水洗至中性，60 °C 烘干即得镍锰双氢化物（NiMn LDH, NML）。将 NML 超声溶于混合溶液（V超纯水: V乙醇= 2 : 1）制备为 3 mg/mL，加入 1 mg/mL N-CNTs 室温搅拌 24 h，离心水洗分散即得 NML@N-CNTs 复合物。
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全文总结
本研究主要基于纳米材料的信号放大策略，使用简便的方法成功合成了不同的纳米材料构建电化学传感器，成功用于呼吸疾病相关生物标志物的检测，为疾病的诊断提供了一种新的检测方法。主要内容和结果如下：
1. 本部分使用相转移法首次合成了 C60@PAMAM-MOF 纳米材料，构建 miRNA传感器检测特发性肺纤维化中的 miR-3675-3p。结果显示，miRNA 传感器在10 fM ~10 nM 内呈线性关系、线性方程为 I = 1.1301 lgc + 3.2623（R = 0.9976）、检测限为 2.99 fM 。该传感器连续扫描 30 圈后电流值为 93.73%、储存 14 天后电流值仍为 82.11%，稳定性良好；重复性的批内批间 RSD 分别为 3.05%和 2.35%；且能与其他干扰 miRNA 区分开来。在健康人和 IPF 患者血清中均获得了满意的检测结果。
2. 本部分使用直接搅拌法和溶剂热法分别合成了 MXene-AB-PANI 和 3D 花状NML@N-CNTs 纳米复合物，构建夹心型同源双适体传感器检测结核特异性ESAT-6 蛋白。结果显示，适体传感器在 10 fg/mL~100 ng/mL 范围内呈线性关系、线性方程为 I = 2.1041 lgc + 2.6679（R = 0.9986），检出限为 4.07 fg/mL。该传感器具有较高的特异性（能与 MPT64、γ-IFN 和 CFP10 等干扰蛋白区分开）、良好的稳定性（储存 16 天后电流值仍为 88.24%）和重复性。此外，该传感器在加标回收、健康人血清和结核患者血清的实际样本检测中均获得了满意的结果。
综上，本研究制备的 2 种传感器均成功用于疾病标志物的诊断，并在血清检测中获得了满意的结果，但还存在检测临床样本的数量较少等不足，尚需要进一步扩大样本数量进行验证。
参考文献（略）