第一章 文献综述
1.1 积雪草酸及其生物活性
1.1.1 积雪草酸简介
积雪草酸（AA，asiatic acid），是一种具有乌苏烷型骨架结构的五环三萜类化合物，其分子式为 C48H78O5，熔点为 320 ℃，易溶于 DMF，THF 等有机溶剂，不溶于水。AA 是积雪草的活性成分之一，存在于许多传统的医药植物中，并因此而备受关注。根据已有研究表明，其具有抗肿瘤、护肝、伤口愈合、降压以及抗微生物等作用，其中抗肿瘤作用尤其受到学界和临床的关注。其结构见图 1-1。
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Zhang J[11]等就 AA 对多发性骨髓瘤 RPMI 8226 细胞的抗增殖作用进行研究。其采用流式细胞实验、免疫沉淀法等实验方法对细胞周期阻滞和 AA 诱导骨髓瘤细胞粘着斑激酶（FAK）表达水平等进行检测。结果表明，AA 对 RPMI 8226 细胞增殖具有抑制作用，尤其在 35 和 40 μmol/L 浓度下，可导致 G2/M 期阻滞。AA 处理 24h后，FAK 和 p-FAK 的表达水平较对照组明显降低（浓度为 40 μmol/L），这说明 AA能够通过调节 RPMI 8226 细胞的周期进程，从而抑制肿瘤细胞的生长。
Fang[12]等研究发现 AA 可显著减少肿瘤细胞基质胶原蛋白并增加聚乙二醇化脂质体阿霉素（PLD）在肿瘤中的积累，并提高 PLD 的体内作用。这说明，AA 是有效的肿瘤基质重塑和化疗增敏剂，具有成为癌症治疗中的化疗增敏剂的潜力。
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1.2 积雪草酸衍生物及生理活性现状
由于 AA 具有众多的药理性质，使其成为了很多医药学家的研究重点，但由于其生物利用度不高，因此临床应用较少，研究者们为了扩大其临床应用范围，对 AA衍生物进行了深入的研究。Bruno M.F.[34]等人合成了一系列的新型积雪草酸 A 环衍生物，并对其抗 HT-29 和 HeL a 细胞株的增殖活性进行评价，结果显示其活性与 AA相比明显提高。其中，活性最好的化合物 1，在进一步评估额外的癌细胞系（MCF-7,Jurkat 和 PC- 3 细胞）和非肿瘤细胞系中的结果显示，化合物 2 在 G0/G1 期抑制细胞周期，诱导 HeL a 细胞发生凋亡，并且此化合物对癌细胞具有选择性，对于 HeL a 细胞，化合物 2 和顺铂同时治疗后观察到协同作用。Meng[35]等用 PDC 对积雪草酸 C-2、C-3、C-23 位上的三个羟基全部氧化成羰基，与饱和乙二胺乙醇溶液和邻苯二胺乙醇溶液分别反应，对 C-28 位进行酯化和酰胺化，得到 3 类 AA 衍生物。其细胞活性试验显示，化合物 2、3 对 HepG2 和 SGC7901 的抗肿瘤活性最好，与吉非替尼相比其抗肿瘤活性更高，与阿霉素抗肿瘤活性相当。
TONG[36]等人通过酯化、氧化合成两类共十个化合物。分子对接模拟所得化合物与靶蛋白的结合能力，化合物 4 相对于其他化合物与靶蛋白的结合能力最强为-93.46kJ·mol-1。体外抗肿瘤活性测试显示，化合物 5 的活性最强，对 HepG2 和 A549 细胞的 IC50 值分别为 15.63 μmol/L 和 17.12 μmol/L。结构如图 1-8 所示。结果表明将 C-23位酰胺化，C-2 和 C-3 位氧化能够显著提高积雪草酸的活性，为临床研究奠定基础。
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第二章 积雪草酸衍生物的结构设计
2.1 计算机辅助药物设计研究
计算机辅助药物设计又称 CADD 技术，其原理是以计算机化学为基础，通过计算机的模拟预测和计算配体与受体生物大分子之间的关系，进而辅助先导化合物进行优化与设计。计算机辅助药物设计（CADD）一般分为三大部分：活性位点分析、数据库搜寻和药物设计。目前，普遍使用的数据库包括 ZINC 数据库、Pubchem 数据库以及 NCBI 数据库。就药物合成方面而言，CADD 主要有三大优势：（1）快速筛选靶点，提高工作效率；（2）实现高通量筛选；（3）辅助多靶点药物的设计研究[100]。
CADD 的理论基础是受体-配体作用假说和分子模拟，按照受体结构是否已知，将 CADD 技术分为两种，分别为：基于配体药物设计的间接药物设计(LBDD) 和基于结构药物设计的直接药物设计 (SBDD)。LBDD 通常适用三维结构未知，只有活性数据已知的化合物; SBDD 通常适用于已通过如 X 射线晶体衍射或核磁共振等的实验方法，或用理论模拟预测方法如从头设计、虚拟筛选、同源模建等方法获得的受体或与配体复合物的三维结构的体系[101]。CADD 技术的发展已经逐步走向成熟，在药物合成方面发挥着越来越重要的作用。CADD 技术可以大幅缩短新药开发的周期，使新药研发的成本极大地降低，是我国医药产业摆脱依赖仿制，缩小与世界先进水平之间的差距的重要手段[102]。近年来，本课题组利用 CADD 技术中的分子对接方法针对抗肿瘤靶蛋白设计合成了一系列的五环三萜衍生物。
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2.2 基于 Bcl-xL 靶点的积雪草酸衍生物的设计
积雪草中含量最多的一种成分是积雪草酸，它是一种五环三萜酸中的一种，因其药理活性复杂多样，以抗肿瘤作用最为显著，在医药界备受关注。但由于生物利用度不高，近年来对积雪草酸衍生物的研究越来越多，对其抗癌机制的了解也更加透彻。Bcl-xL是从禽类的互补DNA (cD NA) 文库中鉴定出来的，属于Bcl-2家族 I 类成员，具有抑制细胞凋亡的作用。目前已有许多研究报道 AA 可以通过调节几种凋亡调节因子（例如 Caspases、Bcl-2）家族成员的蛋白表达来诱导细胞凋亡。本实验以 Bcl-xL 蛋白为靶点设计并合成了一系列的积雪草酸衍生物。通过 Molegro virtual docker（MVD）软件对目标化合物与 Bcl-xL 靶蛋白（PDB编号：3WIX）的结合能力进行预测和评估，并将结果通过函数打分的方式直接表示出来，分数表示为 Escore（Escore=Einter+Eintra，Einter 表示配体-蛋白质相互作用能量，Eintra 表示配体内部能量），分数的绝对值越大表示其结合能力越强，反之则越弱。结合分数显示化合物 I2: -182.92，化合物 Ⅱ3: -169.73，结合能力均高于母体 AA (-102.36)。模拟结果表明新合成的目标化合物与 Bcl-xL 有较强的亲和力。
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第三章 积雪草酸衍生物的路线设计................................19
3.1 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线...............................19
3.2 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线................................19
第四章 实验部分................................21
4.1 实验仪器与药品....................21
4.1.1 实验材料..................................................21
4.1.2 实验仪器...................................21
第五章 实验结果与讨论...........29
5.1 实验结果.....................................29
5.2 化学实验..............................29
第五章 实验结果与讨论
5.1 实验结果
本文以积雪草酸为母体，Bcl-xL 为靶点，通过构效关系分析，计算机辅助药物设计选等方法对积雪草酸的 A 环及其 C-28 位进行结构优化，最终设计并合成了 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物和 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物两类共 10 个积雪草酸衍生物，其结构均未见文献报道且经 1H-NMR 确证。采用 MTT 法，以 Navitoclax 为阳性对照，测定了所合成的化合物对人肺癌细胞 (A549) 和人胃癌细胞(SGC7901) 的抗肿瘤活性，其中，化合物 Ⅰ2、Ⅱ3 的抑制活性较强。
第五章 实验结果与讨论5.1 实验结果本文以积雪草酸为母体，Bcl-xL 为靶点，通过构效关系分析，计算机辅助药物设计选等方法对积雪草酸的 A 环及其 C-28 位进行结构优化，最终设计并合成了 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物和 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物两类共 10 个积雪草酸衍生物，其结构均未见文献报道且经 1H-NMR 确证。采用 MTT 法，以 Navitoclax 为阳性对照，测定了所合成的化合物对人肺癌细胞 (A549) 和人胃癌细胞(SGC7901) 的抗肿瘤活性，其中，化合物 Ⅰ2、Ⅱ3 的抑制活性较强。
药学论文参考
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第六章 结论
1.本文以计算机辅助药物设计作为设计手段，以积雪草酸结构为改造母体进行结构修饰与改造，以 Bcl-xL 为靶点，最终合成了 10 个新型积雪草酸衍生物。分别为：2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物和 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物。反应过程经 TLC 检测，柱层析分离，结构经1H-NMR 初步得到确认。
2.在合成 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的反应中，选用专一性较强的 PDC 作为氧化剂，并采用硅胶将 PDC 负载起来，一方面可以避免反应物被酸分解；另一方面可以扩大氧化剂与反应物的接触面积增加反应速率。
3.在 C-28 位羧基酰化时会产生 HCl，在反应中加入三乙胺做缚酸剂，有利于反应进行；在将烟酰氧基连接到积雪草酸 A 环 C-2 位时会产生 HCl，以吡啶为溶剂，既能将反应物充分溶解，又能中和反应产生的酸，促进反应的进行。
4.对所合成的积雪草酸衍生物进行抗肿瘤活性测试，结果显示，所有目标化合物对 A549 和 SGC7901 细胞的抑制作用均优于母体积雪草酸，化合物 Ⅰ2 对A549 细胞和 SGC7901 的抑制率分别为 72.39%和 73.62%，IC50值分别为 5.71±0.42和 2.66±0.63 µmol·L-1，化合物 Ⅱ3 对两种细胞的抑制率分别是 65.32%和 68.65%，IC50 值分别为 5.43±0.26 和 4.79±0.72 µmol·L-1，抑制作用强于阳性对照药物Navitoclax。初步的构效关系表明积雪草酸 C-2 位引入烟酰氧基以及 C-28 位酰胺化有利于提高 AA 的抗肿瘤活性。
5.分子对接研究显示，化合物 Ⅰ2 结构中的氮杂环与 Gly B 271 形成氢键，并且结构中的酰胺片段与 Arg B 263 与 Arg A 176 形成氢键与π-π共轭，从而使化合物与 Bcl-xL 蛋白稳定结合。化合物 Ⅱ3 结构中的酰胺片段同样与与 ARG B 263形成氢键与π-π共轭，此外，C-2 位的烟酸酯基与 Gly B 271 形成氢键相互作用，MET B 250 与吡啶环产生共轭，从而使化合物与 Bcl-xL 蛋白稳定结合。
参考文献（略）