第一部分 溶酶体靶向的铈纳米酶载药系统构建及其理化性能表征
第一章 ATP-HCNPs@Ce6 制备及表征
现在纳米材料在生物诊疗上已有很大的进展和应用，各种纳米材料在实践中的应用已经取得了良好的效果，比如 Abraxane、力朴素、诺雷得等，但在医学治疗中对各种各样的功能性纳米材料的要求还比较高。不可否认，深入开展无机纳米生物材料的可控制备、功能组装与临床应用等方面的基础研究已成为国内外生物医学诊疗领域的前沿和热点问题。
生物酶是生物体自身的物质，而诸多疾病都与生物酶的失调相关。因此，具有类酶活性的纳米酶在生物医学领域的应用也备受期待。目前已经有一些纳米酶被尝试应用于疾病诊疗方面。所以本章旨在基于反应环境、分子模板及生成过程等实现对中空二氧化铈纳米酶的可控合成。基于中空二氧化铈纳米酶合成多功能的纳米复合材料，以实现药物负载和可控释放，提高光动力治疗效率，减少或避免毒副作用。
同样，材料的理化性能是分析评价材料的重要环节。因此，本章主要描述不同中空度的中空二氧化铈纳米酶（HCNPs）、中空二氧化铈纳米酶载体（ATP-HCNPs）及中空二氧化铈纳米酶载药系统（ATP-HCNPs@Ce6）的构建、优化及对其物理和化学性质的表征，并对所得结果进行讨论、总结。
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第二章 ATP-HCNPs@Ce6 稳定性及安全性
ATP-HCNPs@Ce6 成功构建后，为了进一步应用此中空二氧化铈纳米酶载药系统，所以不同条件下的稳定性对候选材料是否具有成药性评估具有重要意义。更重要地是，对生物医用材料的要求首先是与生物体成分和组织有相容性，不会引起溶血，不会产生吸收物和沉淀物。
随着越来越多有关纳米毒性的报道，人们对纳米材料安全性的关注也逐渐被提上日程。纳米材料的生物效应是建立在安全无毒的前提下，所以采用生物学方法来检测被检材料的毒副作用，从而预测该材料在医学实际应用中的安全性。
因此，材料稳定性和安全性的研究是必不可少的，本章主要描述 ATP-HCNPs@Ce6 的稳定性及安全性，并对结果进行讨论分析。
400 µL ATP-HCNPs@Ce6 分别与 600 µL PBS（pH=7.4）、RPMI-1640 和含10%FBS 的 PBS（pH 7.4）混合，在室温避光条件下共同孵育 0、1、2、4、12 和24 h。各时间点孵育完毕后将混合系统以 7000 rpm 离心 5 分钟，然后静止观察 ATP-HCNPs@Ce6 的稳定性并拍摄数码照片。
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第二部分 溶酶体靶向的铈纳米酶载药系统体外光动力治疗研究
第一章 ATP-HCNPs@Ce6 细胞摄取能力
纳米材料的性质与其生物学效应之间具有很大的关系。其中，纳米材料与细胞的相互作用是最重要的生物学效应之一。细胞摄取纳米材料是纳米材料产生生物学效应的重要基础，因此研究纳米材料的细胞摄取有重要意义。因此，研究纳米材料与细胞的相互作用，尤其是纳米材料的细胞摄取，对于研究纳米材料的生物效应以及开发纳米材料在生物医药领域中的潜在应用至关重要。
应用体外各种细胞（如肿瘤细胞）探究 ATP-HCNPs@Ce6 对药物摄取的动力学特征，可以定量预测其在体内的吸收、分布、排泄等过程，为新药开发和临床合理用药提供重要的参考。
本章主要通过流式细胞仪（FCM）定量分析 4T1 乳腺癌细胞是否将 ATP-HCNPs@Ce6 摄取进入细胞，并对其摄取量效时效关系进行探讨、总结。
为评估 ATP-HCNPs@Ce6 的细胞摄取，将 4T1 细胞（1×105细胞/孔）接种在6 孔板中并于细胞培养箱孵育 24 h。随后在不同孵育时间点（0、2、4、8、12 和 24 h）添加等量的 ATP-HCNPs@Ce6（终浓度 2 µM）。然后将细胞用 PBS 润洗 3 次，胰蛋白酶消化后重悬于 PBS 中。最后通过 FCM 根据 Ce6 的荧光分析肿瘤细胞对ATP-HCNPs@Ce6 的摄取行为及量效时效关系，并用 OriginPro 2017 软件绘制细胞摄取图。
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第二章 ATP-HCNPs@Ce6 体外生物相容性
体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测纳米生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。体外细胞毒性试验是纳米生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是生物材料临床应用前的必选项目。近年来，大量分子生物学检测手段的应用使生物材料的评价向细胞和分子水平迈进。纳米生物材料的毒性与其尺寸、形貌、表面修饰、浓度、制备方法及作用时间等均有密切关系，因此对生物医学材料进行体外安全性评价是生物材料应用的关键环节。
本章主要通过 CCK-8 定量检测方法对 ATP-HCNPs@Ce6 的体外细胞生物相容性性进行评价。
将 Raw 264.7 细胞以每孔 5×103个细胞接种于 96 孔板中，并在 5% CO2和 37 °C的细胞培养箱中孵育过夜。加入不同浓度（相当于铈的终浓度 0、0.1、10、50 µg/mL）的 HCNPs、DSPE-PEG-NH2-HCNPs、ATP-HCNPs 和 ATP-HCNPs@Ce6 继续共孵育 12 h。单一浓度设置三个复孔。用 PBS 润洗后，避光加入含 10% CCK-8 的培养基溶液，再孵育 2~3 h。然后用酶标仪检测各孔在 450 nm 处的 OD 值，计算细胞活力，并用 OriginPro 2017 软件绘制细胞活力图。
将 Raw 264.7 细胞和 4T1 细胞以每孔 5×103 个细胞的密度分别接种于 96 孔板中，并在 5% CO2和 37 °C 的细胞培养箱中孵育过夜。加入不同浓度的 ATP-HCNPs@Ce6（相当于 Ce6 的终浓度 0、0.5、1、2、5 µM）继续共孵育 12 h。单一浓度设置三个复孔。后续步骤同上。
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第三部分 溶酶体靶向的铈纳米酶载药系统体内光动力治疗研究 ........................ 58
第一章 ATP-HCNPs@Ce6 体内药效学 .................................. 58
1 材料与方法 ................................... 58
2 结果 ............................................. 59
3 讨论 ................................. 62
全文总结 ...................................... 69
第三部分 溶酶体靶向的铈纳米酶载药系统体内光动力治疗研究
第一章 ATP-HCNPs@Ce6 体内药效学
药效学研究是新药开发过程中的重要内容，贯穿于新药开发的整个过程。药效学研究内容主要包括验证药物在不同模型中的有效性，表征药物作用的量效、时效关系，探索药物的给药方案。同时体内试验是在生物整体水平上的研究，是支持临床拟用适应症有效性的重要依据。
建立生物材料对分子、细胞、机体相互作用的系统性评价是生物材料评价的发展趋势和最终目的。因此，本章通过建立小鼠三阴性乳腺癌肿瘤荷瘤模型对 ATP-HCNPs@Ce6 体内药效学进行验证，并对所得结果进行讨论和分析。
本课题的实验动物由重庆医科大学实验动物中心提供，为雌性 BALB/c 小鼠（20~25 g）。所有动物实验均已由重庆医科大学动物伦理委员会批准，并根据《动物实验管理条例》使用。将健康 BALB/c 小鼠随机分为 6 组，分别是 PBS、Ce6、Ce6+Laser、ATP-HCNPs、ATP-HCNPs@Ce6、ATP-HCNPs@Ce6+Laser 组。每组 6只小鼠，可自由进食和饮水。首先通过将含有 4T1 的 PBS 细胞悬液 100 µL（含5×106个 4T1 细胞）皮下注射到 BALB/c 小鼠的右背后方来制备荷瘤小鼠。待瘤球生长至适当大小，将 20 µL 不同的治疗组（相当于 50 µM Ce6）通过瘤内注射到荷瘤小鼠中。两小时后用 660 nm 激光发射器以 200 mW cm-2的功率密度照射所有Laser 组的肿瘤部位 5 min，其余组不做任何处理。然后在 48 h 后每组处死 1 只小鼠，收集肿瘤并用 4%多聚甲醛固定 24 h 中以制备病理切片观察肿瘤坏死情况。同时观察并记录其余小鼠在 2 周治疗期内的体重和肿瘤体积变化，以研究 ATP-HCNPs@Ce6 的体内 PDT 作用。
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全文总结
本研究基于铈纳米酶，通过生物来源的 ATP 配位结合修饰和物理吸附装载光敏剂，形成了中空结构可控、酶学活性可调、能通过多途径协同发挥抗肿瘤作用的中空铈纳米酶载药系统 ATP-HCNPs@Ce6。该系统克服了肿瘤缺氧微环境、铈纳米酶稳定性差、光敏剂的疏水性问题和低的生物利用度，提高了氧依赖型光动力疗法治疗肿瘤的效果。体内、体外研究表明，该系统具有良好的稳定性和生物相容性，可靶向肿瘤溶酶体。通过化学、体内和体外实验证实该系统能特异性响应肿瘤细胞内高水平的过氧化氢以及溶酶体内的弱酸性，发挥模拟过氧化氢酶学活性，将肿瘤细胞内过氧化氢转变为氧气，缓解肿瘤缺氧微环境的限制。同时 ATP-HCNPs@Ce6作为一种原位产氧剂，在外加光源照射下，产生的氧气会进一步被装载的光敏剂转化为大量的活性氧，进而杀死肿瘤细胞，提高增氧协同光动力治疗效果。
现将全文总结如下：
（1）本研究使用一锅法及纳米自组装技术合成了 HCNPs，其中空程度精确可控。 （2）ATP 作为 HCNPs 的表面涂层，提高了 HCNPs 的稳定性和生物相容性。其次，ATP 可调节 HCNPs 的模拟酶学活性。 （3）ATP-HCNPs 作为药物载体可递送光敏剂药物 Ce6，解决了生理环境下Ce6 难溶于水的限制，提高了其生物利用度，从而增强了 PDT 效率。 （4）ATP-HCNPs@Ce6 作为一种新型原位产氧剂，提供了一个有用的平台，可实现靶向溶酶体的肿瘤协同光疗。同时，体内外实验表明 ATP-HCNPs@Ce6 安全性良好，为其在乳腺癌治疗中的广泛应用奠定了一定基础。
综上，简单的合成方法、良好的生物相容性和增强的 PDT 效率使 ATP-HCNPs@Ce6 有望成为乳腺癌的精准治疗剂。
参考文献（略）