1. 文献综述
1.1 研究背景
1.1.1 肺损伤
动物肺组织受到细菌或病毒感染时，肺组织细胞及机体内的免疫细胞会发生应急反应以抗拒感染。但这种应急反应，并不总是有益的，过多会引起肺组织的损伤，导致肺部炎症和急性肺损伤（ALI）(Diep et al 2010)，更严重的甚至会导致急性呼吸窘迫综合症（ARDS）(Fidalgo et al 2014)。肺的组织细胞及体内的免疫细胞是如何反应的，特别是肺的组织细胞如何与体内的免疫细胞相互作用，目前还不是很清楚，因此进行研究，对 ALI 和 ARDS 的发病机理及针对性治疗都是很有帮助的。猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）是影响猪呼吸道的传染性病毒(Shi et al 2010)，能引起猪肺的损伤和呼吸窘迫，主要侵害肺泡及血液等组织的巨噬细胞和单核细胞(Van Breedam et al 2010; Yun and Lee 2013)。
1.1.2 单核细胞在肺的募集
免疫细胞在肺部的募集是一个有序的过程(Soehnlein et al 2009)。感染后 1~2小时，第一波在肺部募集的免疫细胞为中性粒细胞，中性粒细胞募集后，经跨内皮细胞层迁移进入肺泡，释放对抗入侵的细菌和病毒的物质。感染 24~48 小时后第二波在肺部募集的免疫细胞为单核细胞；进入肺组织后的单核细胞可以分化为巨噬细胞和树突细胞(Yona and Jung 2010)。目前两波免疫细胞的有序募集是如何协调的还不完全清楚。组织感染后，分泌一些细胞因子和趋化因子，如细胞因子 TNF 和IL-1(Mizgerd et al 2001)与趋化因子 LTB4 和 PAF(McDonald and Kubes 2010)来募集中性粒细胞；同时，内皮细胞方面也会发生炎症反应，其中内皮细胞表面的一些黏附分子（ICAM-1 和 VCAM-1 等）在短时间内的表达迅速增加(Corcoran et al2006; Wittchen 2009)，介导中性粒细胞黏附在毛细血管壁上穿越血管内皮层而浸润到肺组织中。浸润的中性粒细胞及受影响的内皮细胞和巨噬细胞，分泌单核细胞趋化因子 MCP-1 从而诱导单核细胞在肺组织的募集。黏附和浸润的中性粒细胞是如何调节和影响巨噬细胞分泌 MCP-1 的还不是很清楚。由于单核细胞具有多样性，单核细胞穿越血管内皮而浸润到组织后分化成巨噬细胞和树突细胞，因而单核细胞募集相对比较复杂。单核细胞的募集和浸润对炎症的维持和消失都有着积极的作用，因此对单核细胞募集的研究有助于炎症和器官损伤的控制。
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1.2 细胞间黏附分子 ICAM-1 的研究进展
细胞黏附分子（CAMs）是能介导细胞与细胞外基质间相互结合起黏附作用的糖蛋白，在介导炎症反应、维持组织结构和机体发育等方面起重要作用(Vallelyet al 2002)。ICAM-1 属于 CAMs 免疫球蛋白超家族，蛋白大小 100KD 左右，在内皮细胞、上皮细胞及淋巴细胞的表面表达(van de Stolpeandvan der Saag 1996)。当受到炎症因子的刺激时，ICAM-1 在数小时内的表达会迅速增加。内皮细胞表面的 ICAM-1 为白细胞提供黏附位点，并介导白细胞跨血管内皮层迁移(Lawsonand Wolf 2009)。跨血管内皮层的迁移分为以下四个步骤：（1）白细胞的滚动；（2）趋化因子的激活；（3）静息/黏附；（4）经内皮迁移。血管内皮被激活，产生炎性（图 1-1）。白细胞外渗，并迁移到受感染的部位发挥作用(Muller 2011; Springer1994)。肺损伤发生过程中，炎性细胞的黏附是重要的环节，炎症细胞在肺内的游走、聚集和免疫细胞激活的过程中，黏附分子的表达起到了关键作用(Hayashi et al2005; Wang et al 1998; Zhou et al 2005)。有研究发现，在腺病毒肺炎和呼吸道合胞病毒中，ICAM-1 与其受体结合造成炎性细胞的黏附和聚集(Troelstra et al1999)。ICAM-1 的受体是 CD11/CD18，受体在正常单核细胞和中性粒细胞膜上呈低水平表达(Yang et al 2005)。研究显示，呼吸道合胞病毒诱导的毛细支气管炎的患者鼻咽分泌物中，CD18 的表达量显著增加；在败血症病理条件下，中性粒细胞中 CD18 的表达量也明显增加。CD18 与 ICAM-1 相互作用介导中性粒细胞与内皮细胞的黏附，表现为炎症的早期反应，也是造成肺血管损伤的关键步骤(Kang et al 1996; Kumasaka et al 1996)。
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1.3 单核细胞趋化因子 MCP-1 的研究进展
1.3.1 趋化因子的作用
趋化因子是一种分泌蛋白，在维持机体的稳态和病理过程中发挥核心作用(Schall and Bacon 1994)。最初的研究认为这些分子仅调控白细胞的运输，随后有研究指出，趋化因子还参与了炎症过程的其他方面，如纤维化、组织重构和血管生成(Lukacs 2001)。趋化因子可调控嗜中性粒细胞、淋巴细胞、抗原呈递细胞、树突细胞和单核细胞/巨噬细胞的细胞迁移(Deshmane et al 2009)。在炎症条件下，趋化因子协调白细胞的募集、活化和浸润，参与了炎症反应的固有免疫和后天免疫过程(Rotandvon Andrian 2004)。在炎症过程中，迁移细胞倾向于朝向趋化因子浓度高的方向移动。内皮细胞的趋化因子诱导白细胞的滚动和跨内皮迁移(Callewaere et al 2007)。趋化因子的浓度差引起的迁移细胞的移动，而在迁移期间趋化因子受体本身在细胞质膜上仍保持均匀分布(Colditz et al 2007)。在功能上，趋化因子可以分为两个主要的亚家族：炎性趋化因子和稳态趋化因子。炎性趋化因子控制炎症和组织损伤后白细胞的募集，而稳态趋化因子维持机体的正常免疫，如二级白细胞淋巴器官，骨髓和胸腺等(Wagner et al 2007)。
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2．研究目的与意义
鉴于目前 miR-124 在巨噬细胞中对 MCP-1 的调控和 ICAM-1 是否调控miR-124 的表达都无相关报道，因此有待于进一步的研究。本课题根据 ICAM-1敲除小鼠的肺部观察到 MCP-1 的蛋白表达增加的事实，提出并将验证科学假说：ICAM-1 通过 miRNA 调节 MCP-1 的表达，进而影响巨噬细胞的极化。本研究选择 ICAM-1 作为中性粒细胞黏附分子的代表，MCP-1 作为单核细胞募集因子的代表，研究 ICAM-1 在巨噬细胞中对 MCP-1 的作用，将有助于了解单核细胞在肺部的募集，以及单核巨噬细胞极化调控的机制。可为肺部疾病，如急性肺损伤、肺动脉高压和猪繁殖与呼吸综合症等疾病的发病机理提供研究基础。
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3．材料与方法......15
3.1 实验动物、组织和细胞系..........15
3.2 菌株和质粒.......15
3.3 主要试剂和试剂盒....17
3.4 培养基和试剂的配制.........17
3.5 分子生物学分析软件.........18
4. 试验方法........... 20
4.1 引物设计及相关核苷酸序列......20
4.2 细胞的培养.......21
4.3 组织或细胞中总 RNA 的提取............ 22
4.4 小 RNA 测序与生物信息学分析........ 22
4.5 荧光定量 RT-PCR 检测基因 mRNA 和 miRNA 表达水平............24
4.5.1 mRNA 水平检测..... 24
4.5.2 miRNA 的检测........25
4.6 质粒的构建.......26
4.7 无内毒素质粒小量提取.....30
4.8 细胞的传代培养........30
4.9 脂质体（Lipofectamine2000）介导的转染法......31
4.10 蛋白免疫印迹..........31
4.11 双荧光素酶实验......33
6. 讨论
动物机体肺组织受到炎症或感染时（如肺损伤、猪呼吸综合症等），免疫细胞的募集是一个有序的过程。内皮细胞表面的 ICAM-1 介导中性粒细胞黏附在血管壁上并穿越血管内皮浸润到肺组织中，进而诱导单核细胞在肺组织募集，黏附和浸润后中性粒细胞及受影响的内皮细胞和巨噬细胞分泌单核细胞趋化因子MCP-1。黏附和浸润的中性粒细胞是如何调节巨噬细胞分泌的 MCP-1 的，目前还不是很清楚。目前有研究表明，很多宿主 miRNA 被证实参与调节机体的炎症反应，然而，miRNA 是否影响肺组织和巨噬细胞中 MCP-1 的表达的及 ICAM-1是否能通过 miRNA 来调节 MCP-1 的表达还不是很清楚。在本研究中，我们发现 miR-124 在 ICAM-1 敲除的小鼠肺组织中处于降低的表达水平，证实 MCP-1是 miR-124 在巨噬细胞中的靶基因，并且 ICAM-1 能通过 miR-124 来调控 MCP-1蛋白的表达。
6.1 ICAM-1 敲除影响 MCP-1 和 miR-124 的表达
研究显示，过敏性脑脊髓炎及 LPS 诱导的炎症过程中，脊髓血管周围的巨噬细胞炎性细胞因子和趋化因子的表达增加(Hofmann and Lachnit 2002; Zhu andZhang 2016)。但细胞因子和趋化因子是如何相互影响的，目前还没有研究。我们发现在 ICAM-1 敲除的小鼠肺组织中 MCP-1 的蛋白表达增加，心脏和肾脏组织中 MCP-1 的表达下调。这表明，ICAM-1 可能在肺组织中特异地抑制 MCP-1的产生。我们还发现小鼠单核巨噬细胞内 ICAM-1 的敲低导致 MCP-1 蛋白表达增加，这与肺组织中的结果是一致的。由于 miRNA 能参与调节机体的炎症，并以多种方式参与细胞的生命活动过程(Cao et al 2007)，我们推测 miRNA 可能参与 ICAM-1 对 MCP-1 的调节。为了找出参与调控的潜在 miRNA，我们使用小 RNA 测序的方法，在 ICAM-1 基因敲除小鼠肺组织中，检测 miRNA 的表达水平。我们发现多种 miRNA 的表达都有不同程度的增加或减少，其中 miR-124 在 ICAM-1 基因敲除小鼠中的表达水平与野生型小鼠相较显著降低。我们的研究结果表明了 ICAM-1 基因敲除后 miR-124表达水平降低，MCP-1 的表达增加。我们推测 miR-124 可能会影响趋化因子MCP-1 的表达，进而影响其对单核细胞的募集。
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结论
1. 小鼠肺组织中，ICAM-1 敲除促进 MCP-1 的表达，抑制 miR-124 的表达。2. 体内和体外实验中，MCP-1 是 miR-124 的靶基因，转录和翻译都受 miR-124的调控。3. 转录因子 SP-1 激活 miR-124 的转录。4. ICAM-1 和 miR-124 促进巨噬细胞的 M2 极化，具有抗炎作用。5. MiR-124 能抑制小鼠和猪的急性肺损伤，为肺部炎症和免疫治疗提供直接或间接的靶向作用。
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参考文献（略）